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地鳖(Eupolyphaga sinensis Walker)是《中国药典》记载的正品活血化瘀类动物药材,中医处方亦用其治疗肿瘤,尤其将其用于治疗消化道肿瘤较为普遍,民间亦有用其治疗原发性肝癌、胃癌、黑色素瘤、鼻咽癌等的记载。实验室前期研究以中药材中华真地鳖为原料,采用匀浆、盐析、硫酸铵分段沉淀、透析和DEAE-52纤维素离子层析等纯化方法,分离纯化得到的一组纤溶活性蛋白(Fibrinolytic Proteins of Eupolyphaga sinensis, EFP),并通过体外实验证明了EFP对部分肿瘤细胞有显著的细胞毒性作用。本实验在此研究基础上,用酶促动力学方法测定了EFP的酶活力及米氏常数Km值,并采用亲和层析的方法提取EFP。实验分别采取了2种给药方式(直接给药和含药血清),进一步探讨不同浓度的EFP和EFP含药血清分别作用于A549,HepG-2, MCF-7, HUVEC细胞株,于48h采用MTT法检测各组EFP和含药血清组对肿瘤细胞株及血管内皮细胞增殖的抑制率。根据血清药理学的方法,不同浓度EFP作用人肺癌A549细胞48h,应用Annexin V-FITC/PI荧光双染色法检测细胞凋亡,采用流式细胞仪检测细胞周期的变化,采用免疫组化法检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax表达水平的改变。李兴暖等已证明了EFP具有诱导人微血管内皮细胞HUVEC凋亡的作用及凋亡细胞周期变化,本实验在此基础上,用不同浓度EFP作用HUVEC细胞48h,采用免疫组化法检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax表达水平的改变。结果表明,EFP酶比活力为3790.85BAEE单位/mg,米氏常数Km为0.571 mmol/L,酶反应最大的速度为Vmax 0.0364。从亲和层析实验中得出,鸡卵粘蛋白不是EFP的抑制剂。EFP直接用药对部分肿瘤细胞有一定的增殖作用,如HepG2细胞,即EFP对HepG-2没有细胞毒性。而EFP含药血清对A549,HepG-2,MCF-7,HUVEC细胞均有抑制作用,并随EFP浓度的升高而抑制作用增大。含药血清比直接给药更能真实的反映药物作用。EFP能改变人肺癌A549细胞的周期分布,使细胞阻滞于G0/G1期,并增强A549细胞bax的表达,抑制bcl-2的表达,从而诱导细胞凋亡。EFP作用HUVEC细胞48h,随着药物浓度的增加.Bcl-2表达逐渐减弱,Bax表达逐渐增强。