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海藻糖是功能性低聚糖,具有非还原性、保湿性、热酸稳定性、抗冻结、干燥性等特性,而且它对生物大分子和生物体组织有着非特异性的保护作用。海藻糖在食品工业、医学、化妆品工业、农业等领域有着广阔的应用前景。但是海藻糖制取上的困难限制了它的广泛应用。本课题立足从长白山温泉附近土壤中筛选出产海藻糖合成酶菌株,对其酶解产物进行TLC、DNS、HPLC方法综合使用,快速准确的筛选得到理想的实验菌株并且初步鉴定其为芽孢杆菌属(Bacillus)。研究其培养特性,然后对该菌株所产海藻糖合酶进行分离纯化和酶学性质的研究,通过SDS-PAGE确定其分子量,确定其合酶的全新性。
本课题首先从筛选平板培养基中得到3株菌株,对各菌株分别进行发酵产酶培养,通过TLC方法定性分析酶解产物得到2株可能产酶菌株,分别命名为SH-110,SH-111,利用两种不同的显色剂进行显色,确定其酶解产物中确实含有非还原糖,再对这两株菌株利用DNS方法确定所产非还原糖的量,得到产非还原糖量较大SH-110菌株,进而对其酶解产物进行HPLC准确分析产物为海藻糖,测定峰面积,利用外标法计算出海藻糖含量与DNS方法比较,确定DNS方法测得海藻糖含量的准确性。并把SH-110菌株作为下一步实验的出发菌株,结合其个体形态特征,菌落形态特征,革兰氏染色阳性等特征,并参考《伯杰氏细菌鉴定手册》和《芽孢杆菌属》菌属特征,均与短小芽孢杆菌的特征相同,而与其他芽孢杆菌具有明显差别,因而暂将该菌定名为短小芽孢杆菌一个菌株(BacilluspumilusSH-110)。
对实验菌株进行培养基优化研究,采用正交试验方法,确定最佳培养基配方为(%):1%麦芽糖、0.5%蛋白胨、0.2%牛肉膏、0.1%K2HPO4、0.12%NaH2PO4。利用单因素实验确定最佳产酶发酵条件为:最佳发酵温度为36℃,最佳发酵pH值为7.2,选取最佳装液量为150ml,发酵终点确定为48小时。
对实验SH-110菌株所产粗酶液进行逐步分离纯化,探索一条快速分离纯化海藻糖合酶途径。通过硫酸铵盐析、凝胶过滤层析、离子交换层析得到酶液纯化倍数10.35,回收率13.8%,通过PAGE电泳确定分离纯化达到了电泳纯。通过SDS-PAGE和酶学性质研究确定该酶的全新性。通过SDS-PAGE电泳得到合酶的分子量为62.4KD,海藻糖合酶最适作用温度为25℃-45℃,最适反应温度35℃。海藻糖合酶在25℃-40℃可以稳定保存。海藻糖合酶当pH值为7.0时酶活力最高。金属离子对酶活性有明显的作用,Zn2+提高酶活性16%,K+,Na+提高酶活性5%,Mg2+对酶活性稍有提高,而Ba2+,Ca2+,Mn2+则分别使酶活性明显降低。该海藻糖合酶能以麦芽糖为底物,将其转化为海藻糖,酶的底物特异性极强。按照Lineweaver-Burk双倒数作图,求得该酶的Vmax=172.9mmol/1,Km=4.548mmol/1。