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目的：探讨红活麻总香豆素发挥免疫抑制作用的分子机制。通过观察红活麻总香豆素抗Ⅱ型胶原型关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)大鼠的作用,明确其抗类风湿关节炎作用及可能的分子机制;通过体外培养小鼠树突状细胞(DC),测定其表型(CD11c、CD86、MHC-Ⅱ)及功能(MLR反应)变化以及PD-L1抗体对红活麻总香豆素影响DC细胞的逆转作用,结合红活麻总香豆素体内对小鼠CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞分化和CTLA-4表达的影响,明确红活麻总香豆素发挥免疫抑制作用的分子机制。 方法：(1)于Wistar大鼠左趾皮内多点注射1ml的CⅡ乳剂(2mg/mlⅡ型胶原醋酸溶液与等量完全弗氏佐剂乳化制得),第21d于大鼠尾根部注射同等乳剂加强刺激,建立CIA模型。造模成功后大鼠随机分6组:正常对照组、CIA模型组、红活麻总香豆素小剂量(19mg/kg)组、红活麻总香豆素中剂量(37.5mg/kg)组、红活麻总香豆素大剂量(75mg/kg)组、甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)阳性对照组,每组10只。大鼠于首次免疫后21d给药组每日灌胃给于相应剂量的红活麻总香豆素,并记为给药第0d,连续2w;正常对照组及模型组给予等量生理盐水(NS);阳性对照组大鼠每日肌肉注射MTX0.2mg/kg,连续2w。每隔两日测定各组大鼠体重、左趾足趾肿胀度,并进行关节评分。末次给药后各组处死部分大鼠,分离脾脏,制备淋巴细胞悬液,观察各组大鼠脾淋巴细胞增殖情况。取左后踝关节进行HE染色,观察大鼠骨、关节软骨组织破坏及炎性细胞浸润情况。分离大鼠骨髓来源DC,培养至第7d进行混合淋巴细胞反应,研究DC功能变化。其余大鼠停药一周继续观察。 (2)体外诱导小鼠骨髓CD11c+细胞,与不同浓度红活麻总香豆素(1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml)共培养。第7d检测红活麻总香豆素对树突状细胞表面抗原MHC-Ⅱ、共刺激因子CD86及程序性死亡配体-1(PD-L1)的影响,噻唑蓝(MTT)法检测红活麻总香豆素处理的DC在不同刺激比情况下体外刺激同种T细胞增殖的活性,确定红活麻总香豆素体外影响DC表型和功能的最佳剂量;在红活麻总香豆素作用于DC细胞基础上,进行PD-L1抗体(10μg/ml)阻断,研究红活麻总香豆素对DC的影响是否通过PD-1/PD-L1通路;红活麻总香豆素(150mg/kg)灌胃给予Balb/c小鼠4w,流式细胞术(FACS)检测药物对小鼠CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞分化和CTLA-4表达的影响。 结果：(1)采用CⅡ乳剂可以建立Wistar大鼠胶原性关节炎模型,表现为大鼠四肢关节红肿,行动迟缓。与模型对照组比较,给药组高、中、低三个剂量呈剂量依赖性的降低CIA大鼠的关节肿胀(P<0.05)和关节指数(P<0.05),其中高剂量组效果更为明显,与阳性药MTX相当;HE镜检发现,CIA模型组大鼠可见明显的滑膜细胞增生和炎性细胞浸润,骨及关节软骨组织有明显侵蚀损伤,红活麻总香豆素治疗后,可有效的减少炎性细胞浸润,骨及软骨组织形态尚见完好,未见血管翳形成;停药后一周,红活麻总香豆素给药组大鼠关节肿胀没有复发,预后效果良好;在ConA诱导的脾脏T淋巴细胞增殖实验中,与CIA模型组相比,给药高、中剂量组大鼠显示出较为明显的剂量依赖性抑制T细胞增殖的作用(P<0.05);混合淋巴细胞反应显示给药组大鼠DC在1:10的刺激比下均显著降低对同种T细胞的增殖作用。 (2)FACS结果显示,相比于对照组,红活麻总香豆素(10μg/ml～50μg/ml)可剂量依赖性的降低DC表面共刺激分子CD86及MHC-Ⅱ的表达,下调DC对同种淋巴细胞增殖的能力,且刺激比为20:1时作用最为明显,100μg/ml、150μg/ml红活麻总香豆素体外影响DC表型和功能与50μg/ml红活麻总香豆素作用相当,我们选取50μg/ml为红活麻总香豆素体外最适宜浓度;在红活麻总香豆素作用于DC细胞基础上,进行PD-L1抗体(10μg/ml)阻断,发现PD-L1可有效的逆转药物对DC细胞表型和功能的影响;体内给予小鼠红活麻总香豆素发现,相比于空白对照组,红活麻总香豆素可明显上调小鼠DC细胞PD-L1的表达( P<0.05),且CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞分化增加(P<0.05),CTLA-4表达上升。 结论：实验结果初步证明: (1)红活麻总香豆素具有抗大鼠CIA作用,表现出良好的免疫抑制作用。停药后预后效果良好,对DC细胞的刺激功能有较强的抑制作用,提示其可能通过诱导免疫耐受发挥疗效。 (2)红活麻总香豆素体外可通过PD-1/PD-L1通路明显抑制DC细胞表型和功能,使 DC处于未成熟状态,同时红活麻总香豆素发挥免疫效应与促进 Foxp3+调节性T细胞分化和上调CTLA-4表达有关。