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目的： 作为酵母细胞中的一种关键转录因子，Cbf1(Centromere-binding protein1)参与并调控了包括呼吸作用、脂质合成以及甲硫基酸合成等多种通路相关基因的转录激活。课题组前期研究发现，相对于免疫沉淀(IP)策略富集细胞内所有的Cbf1，仅采用DNA Pulldown方法以富集Cbf1转录复合体，可以鉴定到Cbf1蛋白的K271位点被高度泛素化，暗示仅少部分Cbf1可发生泛素化修饰，且K271位点泛素化修饰可能参与转录激活调控。因此，本课题以酿酒酵母为研究对象，旨在研究Cbf1蛋白K271位点泛素化修饰特异性参与某些生物学过程的调控机制，并验证其生物学功能。 方法： 1.JMP024-cbf1△、JMP024-3HA-Cbf1和JMP024-3HA-Cbf1K271菌株的构建 1.1JMP024-cbf1Δ菌株的构建 在SGD数据库中获取Cbf1蛋白的基因序列，合成含有Cbf1基因上游和下游同源序列和卡那霉素ORF两端序列的引物，然后以卡那霉素抗性基因为模板，采用PCR扩增技术扩增敲除元件。将敲除元件转化到JMP024感受态细胞中，涂布于YPD-G418平板上，筛选转化子，并通过菌落PCR筛选阳性克隆。 1.2JMP024-3HA-Cbf1菌株的构建 首先合成用于扩增3xHA片段和Cbf1片段的上、下游引物，分别以pRS316质粒和酵母基因组DNA为模板扩增3xHA片段和Cbf1片段，然后通过融合PCR扩增得到3xHA-Cbf1片段。将融合扩增得到的3xHA-Cbf1片段连接到pMD18-T载体上。转化细胞，提取质粒并测序。以测序正确的质粒为模板扩增3xHA-Cbf1片段，转化到JMP024-cbf1Δ细胞中，涂布于SD-Met培养基中，筛选转化子，并通过菌落PCR筛选阳性克隆。 1.3JMP024-3HA-Cbf1K271R菌株的构建 设计合成Cbf1K271R点突变引物，以3HA-Cbf1-T质粒为模板进行PCR扩增。反应结束后，加入DpnⅠ限制性内切酶消除模板质粒DNA，转染细胞，提取质粒并测序。以测序正确的质粒为模板扩增得到3HA-Cbf1K271R片段，转化到JMP024-cbf1Δ感受态细胞中，涂布于SD-Met平板上筛选转化子，通过菌落PCR筛选阳性克隆。 2.Cbf1点突变和野生型菌株中Cbf1表达量和菌株生长状况比较 2.1Cbf1表达量检测 培养Cbf1点突变和野生型菌株，在变性条件下提取细胞总蛋白并测定蛋白浓度。通过Western Blot和SILAC定量蛋白质组学检测Cbf1点突变菌株和野生型菌株中Cbf1含量是否有差异。 2.2生长状况表征 YPD培养Cbf1点突变和野生型菌株，以相同起始OD600转接到SC和SD+Met液体培养基中，每隔2h测菌液OD600，每株菌设置两个平行生物学重复并计算标准差。取指数生长期的菌体(OD600=1.0)于离心管中，倍比稀释为四种浓度，点在SC和SD+Met平板上，每12小时拍照，观察表型。 3.Cbf1K271位点泛素链在甲硫氨酸合成通路中作用 3.1SILAC定量蛋白质组学 利用SILAC正反标策略培养Cbf1点突变和野生型菌株，并设置生物学重复。取等量轻、重标酵母细胞混合后变性条件下提取全细胞蛋白，经胰蛋白酶消化后通过StageTip快速分离方法制备质谱样品进行鉴定，使用MaxQuant软件对数据进行分析。 3.2实时定量PCR 在SD+Met培养基中培养Cbf1点突变和野生型菌株，置换到新的SD-Met培养基中培养0min、15min、30min、45min收集菌体置于液氮中速冻。研磨法提取RNA，利用反转录试剂盒合成cDNA。设计目的基因引物序列，进行RT-PCR扩增。 4.Cbf1蛋白K271位点特异性调控底物蛋白筛选 通过SILAC定量蛋白质组学方法得到蛋白定量信息，设置卡值标准，筛选差异蛋白。分析差异蛋白功能，并挑选差异蛋白通过RT-PCR进行转录水平验证;通过点板表型实验和生长曲线测绘检测生长状况。 5.Cbf1K271位点泛素化的生物学功能 合成生物素修饰的上、下游引物，以Met4-2367-T质粒为模板进行PCR扩增并回收产物，然后将回收的DNA片段与Dynabeads(@)M-280Streptavidin beads充分结合后，beads与Cbf1点突变和野生型菌株全细胞蛋白混合，以富集与该DNA序列存在相互作用的转录复合物相关蛋白。将富集的蛋白经胶内胰蛋白酶消化后进行质谱鉴定和数据分析。 结果： 1.JMP024-cbf1△、JMP024-3HA-Cbf1和JMP024-3HA-Cbf1K271R菌株的构建 通过菌落PCR和琼脂糖凝胶电泳验证各菌株条带大小符合预期，菌株构建成功。 2.点突变和野生型菌株Cbf1表达量和生长状况检测 Western Blot结果显示，Cbf1点突变和野生型菌株中Cbf1蛋白含量在全细胞蛋白水平并无明显差异。SILAC实验定量结果显示Cbf1蛋白在点突变和野生型菌株中表达量无明显差异。生长曲线测绘和点板表型实验结果显示，点突变和野生型菌株的生长状况较为一致。 3.Cbf1K271位点泛素链在甲硫氨酸合成通路中作用探究 SILAC定量结果显示，除Met22蛋白外，甲硫氨酸合成通路相关蛋白在Cbf1点突变和野生型菌株中表达量基本无差异。RT-PCR结果显示，Met22在点突变和野生型菌株中的转录水平几乎无差异。通路下游位置的蛋白受到缺甲硫氨酸(Methionine)刺激时，在点突变和野生型菌株中转录激活水平无明显差异。点板表型实验结果显示，Cbf1点突变菌株对多种甲硫氨酸浓度刺激不敏感。因此在甲硫氨酸合成通路激活前后K271位点泛素化修饰对该通路相关基因转录激活无明显影响。 4.Cbf1蛋白K271位点特异性调控底物筛选及验证 根据卡值标准筛选到SC培养基中K271R点突变菌株相对野生型菌株有32个差异蛋白，主要参与细胞应激、葡萄糖代谢和生物合成等生理过程。RT-PCR结果显示，GPP2、GRX1和TDH1在Cbf1K271R点突变菌株中转录水平明显下调。生长表型实验结果显示，在含有不同浓度AgNO3固体平板上，Cbf1野生型菌株生长明显受到阻滞。因此，在正常培养条件下，Cbf1K271位点的泛素化修饰可能参与上述蛋白的转录激活过程的调控;在AgNO3刺激条件下，Cbf1K271位点泛素化修饰发挥阻碍细胞应答的作用，具体机制有待探究。 5.Cbf1K271位点泛素化修饰功能 DNA Pulldown纯化结果显示，转录复合体上Cbf1蛋白在野生型菌株中含量超过Cbf1K271R点突变菌株。 结论： 1.Cbf1K271位点上泛素化修饰不影响自身稳定性，Cbf1K271位点泛素链并不介导蛋白质降解功能。 2.Cbf1K271位点泛素化修饰并不参与甲硫氨酸合成通路相关基因的转录激活调控。 3.Cbf1K271位点泛素化修饰可能通过影响Cbf1与某些蛋白编码基因的启动子区域的结合能力，进而影响基因的转录激活。体现了泛素化修饰在调控转录因子靶点特异性过程中的重要作用。