小麦条锈菌体细胞重组的确立与有性重组群体的创建、毒性分析和初步分子分析

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条锈菌致病性的变异(新小种的产生)及传播是导致小麦品种抗锈性失效的主要因素。体细胞重组和有性重组被认为是小麦条锈菌致病性变异的重要原因,但是鲜有实验证据支持这一假说,因此在可控试验条件,获取体细胞重组和有性重组菌系并对其进行准确可靠的毒性及分子标记分析,有利于揭示小麦条锈菌致病性变异的机制,可为新致病力小种的预测及抗病品种的选育和布局提供理论指导。
  体细胞重组方面:本试验利用一套新的18个含Yr单基因的抗条锈病小麦材料作为鉴别寄主并运用大量共显性的微卫星(SSR)和基于分泌蛋白的单核苷酸多态性(SP-SNP)分子标记对可能的体细胞重组菌系进行分析,获得了如下结果:
  1.根据亲本和其子代菌系在18个含Yr单基因的小麦材料上的毒性测定结果以及其在141个分子标记(51 SSR和90 SP-SNP)中的结果,我们认为,在9个组合的共68个子代菌系中,67个菌株为双亲的体细胞重组菌系。
  2.在毒性测试中,我们观察到子代菌株的毒性表型为两亲本菌株毒性表型的重组。这种重组主要有四种类型,一是,子代菌株失去两亲本菌株对某一鉴别寄主的毒性或部分毒性;二是,在两亲本菌株均表现为无毒的某一鉴别寄主上,子代菌株表现为有毒性;三是,子代菌株结合了两亲本菌株对不同鉴别寄主的毒性。四是,子代菌株继承了一亲本在某一鉴别寄主上的毒性和另一亲本在另一鉴别寄主上的无毒性。亲本的毒性/无毒性在体细胞重组子代菌系中的分离和重组为条锈菌无毒基因的遗传研究提供了一种新的思路。
  3.在条形柄锈菌小麦专化型(Puccinia striiformis f.sp.tritici)与条形柄锈菌大麦专化型(Puccinia striiformisf.sp.hordei)间的三个组合中,基于毒性测定,我们共获得16个可能的体细胞重组子代菌系。通过分子标记分析,其中15个子代菌系被证明为重组菌系。这说明在可控的试验条件下小麦专化型与大麦专化型的条锈菌间体细胞重组能够发生,但从试验中获得的重组子代菌株的数量上来看,我们认为体细胞重组在同一专化型中更易发生。
  4.分子标记对亲本及其子代菌株的结果显示,大部分的子代菌株均是通过体细胞重组产生的,体细胞重组的过程包含不同条锈菌小种及专化型间细胞核的融合、染色体的重排以及交换。
  上述试验首次应用了大量的基于DNA序列的分子标记和Yr单基因的抗条锈病小麦材料对可能的条形柄锈菌的体细胞重组菌株进行分析,并证明了在温室条件下,条形柄锈菌小种间、不同专化型间能够发生体细胞重组。本次试验表明在可控的试验条件下体细胞重组是条锈菌遗传变异的一种机制。
  有性重组方面:以美国小麦条锈菌小种PSTv-4为亲本菌株,经其在转主寄主小檗上进行有性自交,共获得了117个有性自交子代群体。利用35个含Yr单基因的小麦材料和分子标记对亲本菌株及其子代群体进行分析,结合毒性及分子标记结果对条锈菌的遗传连锁图谱进行初步绘制,获得结果如下:
  1.亲本菌株及所有的子代菌株对Yr5、Yr10、Yr15、Yr24、Yr32、YrTr1、Yr26、YrCV、YrTre、Yr45、Yr53、Yr64均表现出无毒性,而对Yr1、Yr6、Yr9、YrSP、YrTye、Yr2、Yr21、Yr25、Yr28、Yr29、Yr31、YrA、YrAvs、Yr65均表现出有毒性,这说明在亲本菌株PSTv-4中对应于上述抗性基因的无毒性/毒性为纯合的。而在Yr7、Yr8、Yr43、Yr44、YrExp2、Yr17、Yr27、Yr35、Yr41鉴别寄主上,子代菌株的致病性发生了分离,说明在亲本菌株PSTv-4中与Yr7、Yr8、Yr43、Yr44、YrExp2相对应的无毒性和与Yr17、Yr27、Yr35、Yr41相对应的毒性均为杂合的。
  2.通过统计在致病性分离的鉴别寄主上无毒菌株与毒性菌株的数量,并利用卡方检验对无毒菌株数与毒性菌株数可能符合的分离比进行检验,我们得出对应于Yr7、Yr43、Yr44、YrExp2的无毒性由一对显性基因控制;对应于Yr17、Yr27的无毒性受1对隐性基因控制;对应于Yr8的无毒性由2对显性基因控制;对应于Yr35、Yr41的无毒性由2对隐性基因控制。
  3.在子代群体中共获得了38种毒性表型。在117个子代菌株中,毒性谱比亲本菌株PSTv-4广的菌株数量为40个,占子代菌株总数的34.19%。且在子代群体中,发现了有5个菌株在毒性分离的9个鉴别寄主上均表现为致病。这表明通过有性自交不仅能获得毒性表型众多的子代群体,而且在子代群体中,可能出现较多毒性谱比亲本菌株更广的子代菌株。
  4.在供筛选的342对SSR引物和189个SP-SNP引物中,我们一共筛选到53个可用于遗传连锁作图的分子标记,其中包括SSR标记24个,SP-SNP标记29个。结合子代菌株致病性分离数据,运用Mapmaker/EXP3.0软件及MapDaw2.1程序我们共获得了9个连锁群,连锁群总长为711.2cM,平均距离为19.8 cM。9个无毒/毒性基因分别被标记到3个连锁群中,其中Avr7、Avr44、AvrExp2、Avr43为同一连锁群,而avr35、avr27、avr41、avr17为另一连锁群,但未发现这些基因位点与目前的分子标记相连。Avr8与8个分子标记相连,其中分子标记PstP033与其遗传距离最近,为36.6 cM。
  有性自交重组探讨了小麦条锈菌有性自交子代群体的致病性变异情况,分析了无毒性/毒性位点的纯合或杂合性质以及无毒基因的遗传特性,并获得无毒基因/毒性基因与分子标记的遗传连锁图。这些结果可为小麦条锈菌有性重组、致病性的变异研究以及无毒基因的克隆等提供基础。本试验证明了在可控试验条件下小麦条锈菌的有性重组是该病原菌遗传变异的重要途径。
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