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容积调控阴离子通道(Volume Regulated Anion Channel，VRAC)是一种在细胞体积扩大时被激活的阴离子通道.VRAC在人体组织中表达广泛并具有重要的生理功能.当细胞体积扩大时,VRAC被激活并产生称为细胞调节性容积减小(regulatory volume decrease,RVD)的过程来实现对细胞体积的保护.VRAC与细胞迁移、细胞增殖、细胞凋亡和肥胖等一系列病理、生理过程密切相关.近年来,已经有两个实验室分别发现LRRC8A的同源异聚体是 VRAC 的分子基础,但其激活机制尚不清楚.有文献表明,细胞内钙可能参与 VRAC 的激活,本实验室前期研究结果也证实,当细胞内局部钙浓度改变时会影响 VRAC 的激活.而细胞发生肿胀时伴随着细胞内钙浓度的上升.我们知道细胞内的磷脂酶C(PLC)信号通路的激活会诱发细胞内钙的的释放和细胞内钙浓度的上升.由此我们推测PLC通路可能参与VRAC的激活. 本课题专注于PLC通路对VRAC激活的影响.实验分为两部分:第一部分主要建立了YFP-HEK293A稳转细胞系,以及使用激光共聚焦、电生理膜片钳和 FLIPR 等技术对该稳转细胞系的可靠性进行验证,作为接下来评价PLC亚型对VRAC激活影响的实验的基础;第二部分主要借助FLIPR系统和 YFP-H293A稳转细胞系进行高通量筛选(high throughout screening,HTS)实验来观察使用siRNA沉默不同PLC亚型对VRAC功能的影响,接着使用电生理膜片钳和 qPCR 的方法来进一步验证上述结果,以探索不同PLC亚型对VRAC激活的贡献. 第一部分:YFP-HEK293A稳转细胞系及VRAC功能检测平台的建立. 目的:获得对卤素离子敏感的YFP-HEK293A稳转细胞系,并使用包括HTS平台在内的方法检测稳转细胞系中VRAC的功能来验证稳转细胞系. 方法: 1 搭建YFP-H148Q-I152L质粒并瞬时转染进入空白HEK293A细胞.获得表达YFP的HEK293A细胞. 2 使用灭瘟素处理HEK293A细胞,获得死亡曲线,确定最小致死浓度为15μg/ mL;将YFP-H148Q-I152L瞬时转染进HEK293A细胞,使用无限稀释法获得单个细胞;使用含有15μg/ mL灭瘟素的培养基继续培养获得YFP-HEK293A稳转细胞. 3使用激光共聚焦、FLIPR和电生理膜片钳等方法验证建立的YFP-HEK293A稳转细胞系的功能. 结果: 1.建立的YFP-HEK293稳转细胞系在共聚焦488 nm光源下可激发荧光,在不同批次(N = 7)的实验中,YFP阳性的细胞比率在90.46 % ± 8.34 (N = 7);而瞬时转染YFP时YFP阳性细胞的比率为23.67 % ± 11.56(N = 6).另外,细胞处于低渗条件时(激活VRAC)加入NaI溶液,两种转染类型的细胞荧光强度均下降(进入细胞的I-对荧光的淬灭),且10 μM的DCPIB(VRAC阻断剂)能显著阻断这一荧光降低过程. 2.电生理实验中,在VRAC被低渗外液激活的条件下,稳转细胞系在 -60 mV钳制电压下的电流密度为118.71 ± 14.56 pA/pF(n = 9);空白HEK293A的电流密度为103.24 ± 11.38 pA/pF(n = 13);两者无显著性差异,表明YFP的表达并不影响VRAC电流密度.且两者在低渗条件下诱导的VRAC电流,均能被10μM的DCPIB抑制. 3.在FLIPR的高通量荧光检测实验中,在低渗及I-存在的条件下,稳转细胞系和瞬时转染YFP的细胞荧光强度降低百分比分别为90.68 % ± 4.92(n = 34)和92.13 % ± 3.35(n = 25),两者无显著性差异.在7μM的U73122(PLC阻断剂)和10 μM的DCPIB存在的情况下,由低渗及I-诱发的稳转细胞系的荧光强度降低由原来的93.34 % ± 5.45 (n = 12)分别降低为54.43 % ± 7.68(n = 21,*P< 0.05)和25.61 % ± 3.93(n = 18,**P< 0.01). 结论:激光共聚焦、膜片钳和FLIPR高通量荧光检测实验结果表明:建立的YFP-HEK293荧光蛋白稳转细胞系并不影响HEK293细胞内在的VRAC特性,其表现出与空白HEK293A类似的VRAC特性:在低渗细胞外液条件下5 min左右VRAC完全开放,且可被VRAC阻断剂DCPIB阻断,稳转细胞系成功建立;FLIPR 高通量荧光检测系统可以检测 VRAC的开放. 第二部分:磷脂酶C亚型在VRAC激活中的作用. 目的:利用基因沉默的方法来评价细胞内不同PLC亚型对VRAC激活的影响,利用qPCR的方法确定siRNA的敲除效率. 方法: 1 将靶向不同PLC亚型的siRNA瞬时转染进入YFP-HEK293A稳转细胞系,降低相应PLC亚型的表达. 2使用qPCR技术,检测各个PLC亚型的敲除效率. 3使用FLIPR仪器进行高通量荧光检测实验,通过对荧光强度的检测寻找可影响VRAC功能的PLC亚型. 4进行电生理膜片钳实验来进一步验证高通量荧光检测实验的结果. 结果: 1. PLC阻断剂U73122在膜片钳、FLIPR和激光共聚焦实验中均能显著抑制VRAC通道激活,表明PLC可能参与了VRAC的激活 2. qPCR的结果显示,利用相应siRNA干扰PLCβ3、PLCβ1、PLCζ1、PLCδ4、PLCδ3、PLCβ4、PLCγ1、PLCλ2、PLCη1和PLCχδ1等10种亚型后,PLC亚型表达分别降低54.12 %、61.26 %、67.86 %、57.21 %、51.43 %、59.56 %、49.67 %、71.24 %、65.67 %和55.12 %. 3.在FLIPR的高通量荧光检测实验中发现,低渗诱导的空白对照组荧光强度均显著降低,与低渗诱导的空白对照组87.63 % ± 8.54(n = 48)相比,敲低PLCγ1、PLCβ3、PLCβ1、PLCδ3、PLCδ4、PLCχδ1和PLCλ2 7种亚型后低渗及NaI诱导的荧光强度降低分别为37.66 % ± 4.68(n =18,*P < 0.05)、38.12 % ± 6.89(n = 18,*P < 0.05)、51.68 % ± 9.56(n =17,*P < 0.05)、33.57 % ± 5.46(n =17,**P < 0.01)、22.51 % ± 4.65(n =18,*P < 0.05)、41.78 % ± 11.54(n = 12,*P < 0.05)和44.51 % ± 8.86(n= 17,*P < 0.05),VRAC的激活受到不同程度影响;而敲低PLCβ4、PLCη1、PLCζ1、PLCε1、PLCχδ2、PLCβ2、PLCη2和PLCλ1后低渗及NaI诱导的荧光强度降低分别为84.78 % ± 11.23(n = 17)、80.24 % ± 13.45(n = 18)、80.6 % ± 13.53(n = 12)、81.33 % ± 11.35(n =18)、86.74 % ± 9.69(n = 12)、81.67 ± 9.79(n = 17)和84.33 % ± 11.43(n = 12),与空白对照组均无差异. 4. 在膜片钳实验中,在敲低PLCγ1、PLCβ3、PLCβ1、PLCδ3、PLCδ4、PLCχδ1 和PLCλ2等PLC亚型的稳转细胞系上进行膜片钳实验发现,相比于空白对照组低渗细胞外液条件诱发的 VRAC 电流密度明显减小,分别为22.54 ± 4.32 pA/pF(n = 13,*P< 0.05)、29.68 ± 5.62 pA/pF(n = 12,**P < 0.01)、27.24 ± 6.23 pA/pF(n = 14,**P < 0.01)、35.27 ± 8.62 pA/pF (n = 13,*P< 0.05)、21.65 ± 3.38 pA/pF(n = 17,***P< 0.001)、20.35 ± 7.24 pA/pF(n = 13,**P< 0.01)和32.47 ± 7.64 pA/pF(n = 11,**P < 0.01),而低渗诱导的空白对照组、使用含有无效序列 siRNA 处理的阴性对照组(scramble siRNA组)、PLCζ1、PLCβ4和PLCη1组细胞电流密度分别为128.65 ± 21.34 pA/pF(n = 11)、145.32 ± 17.88 pA/pF(n = 7)、132.92 ± 28.75 pA/pF(n = 9)、113.93 ± 19.85 pA/pF(n = 8)、98.49 ± 19.75 pA/pF(n = 9). 结论:PLCγ1、PLCβ3、PLCβ1、PLCδ3、PLCδ4、PLCχδ1和PLCλ2等七种PLC亚型可能参与了VRAC的激活.