论文部分内容阅读
目的本研究通过观察补阳还五汤预处理Srague Dawley(SD)大鼠,诱导脑死亡(brain death,BD)后对肾脏损伤及细胞凋亡的影响,探讨补阳还五汤预处理对肾脏的保护作用及其可能机制。方法1.实验对象30只SPF级雄性SD大鼠,体质量200-250g/只。2.实验分组30只雄性SD大鼠随机编号为1-30号,其中1-10号为假手术组(D1):麻醉成功后予以股动脉置管、气管插管,但不诱导脑死亡。11-20号为BD组(D2):股动脉置管和气管插管后采用“渐进式”颅内加压法诱导大鼠脑死亡,并维持机械通气6h。21-30号为补阳还五汤预处理+BD诱导组(D3):术前1周每天予以补阳还五汤灌胃(18ml/1kg),每天一次,连续7d,第7天灌胃30 min后诱导大鼠BD,其余步骤同D2组。3.实验方法3.1 BD模型的建立采用渐进式颅内加压法建立大鼠BD模型,采用国际脑死亡判定标准评判建模。3.2检测各组肾脏组织标本中的细胞凋亡TUNEL法检测三组SD大鼠肾脏中细胞凋亡的情况,并分别计算各组细胞凋亡率,采用免疫荧光图对细胞凋亡进行定性分析。3.3检测细胞凋亡通路中Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达采用蛋白印记(western blot,WB)方法检测三组大鼠肾脏组织中Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达水平。WB结果应用Bio-Rad Quantity One软件对条带灰度值进行相对表达量分析。3.4病理学检测苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin,HE)后在光镜下观察三组肾脏组织形态及结构的改变4.统计学分析实验数据以均数±标准差(x±s)表示,用SPSS 13.0统计软件进行t检验、单因素方差分析(analysis of variance,ANVOA),以P<0.05为差异有统计学意义。WB结果应用Bio-Rad Quantity One软件对条带灰度值进行相对表达量分析。结果1.成功建立12只大鼠BD模型:D2和D3组大鼠中,每组成功诱导6只大鼠BD形成,并能维持6h,大鼠平均动脉压(MAP)均在80mmHg以上;2.TUNEL结果显示:D2组凋亡率(0.42±0.09)均显著高于D1组(0.02±0.01)(P<0.01);D3组(0.15±0.01)凋亡率显著小于D2组,高于D1组(P<0.01);3.WB结果显示:与D1组相比,D2组肾脏组织中Bax、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达均显著增高(P<0.01),Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.01);与D2组相比,D3组Bax、Caspase-3、Caspase-9的蛋白表达均显著降低(P<0.01),Bcl-2蛋白表达增高(P<0.05);4.HE染色显示:D1组肾小管和肾小球形态结构未见明显异常;D2组肾小管上皮细胞水肿,颗粒变性,出现梗死、管腔狭窄及管型,肾小球出现萎缩;D3组肾小管上皮细胞稍有水肿,但细胞排列大致规则整齐,细胞变性较D2组减轻,肾小球形态结构未见明显改变。结论1.“渐进式颅内加压法”建立BD模型方法可靠,成功率高;2.大鼠BD后,细胞凋亡参与了肾脏损伤过程;3.补阳还五汤预处理可抑制BD后细胞凋亡从而减少肾脏损伤;4.补阳还五汤可能通过线粒体凋亡途径而抑制细胞凋亡。