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斑马鱼是运用遗传学手段研究胚胎发育机制的理想模式脊椎动物。但长期以来,斑马鱼一直缺乏有效的反向遗传学研究策略,即针对特定基因实现定点修饰进而研究其表型。人工构造核酸内切酶(EEN),包括人工锌指核酸酶(ZFN)和人工类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)技术的出现,为在斑马鱼中实现基因组定点切割,进而为实现基因敲除和其它基因组定点修饰方案提供了可能。 本论文的第一部分工作,主要是为了解决ZFN构建和筛选过程中的难点所做的一些尝试。通过总结和归纳已有的ZFN构建方案,我分析、比较了不同方案各自的原理、特点和优缺点,在此基础上参与设计了两个新的ZFN构建方案:“已知ZFP重新组合”(Known-ZFP-Recombination)方案和MMA(multi-module assembly)方案。同时,我编写了在全基因组层级搜索相关方案候选位点的程序,利用生物信息学方法为各种ZFN构建方案提供辅助手段。“己知ZFP重新组合”方案是一种非常简单易行的方案,可用于实验平台建立和测试ZFN在斑马鱼中的可行性;而MMA方案则是综合了已有各种方案的优点而提出的一种操作简便、成功率高的全新方案。实验结果表明,使用“已知ZFP重新组合”方案构建新ZFN拥有一定的成功率,但ZFN的活性普遍较低。MMA方案则具有非常高的成功率和ZFN切割效率,所引起的定点indel突变可高效地通过种质细胞遗传到后代中。 在优化ZFN构建策略的过程中,一种和ZFN类似、但其构建方案更为简单的新型人工构造核酸内切酶--TALEN被报道可成功实现基因组定点切割和诱变。我们实验室借助ZFN实验平台的基础,开展了在斑马鱼中使用TALEN实现基因组定点突变的工作,并成为世界上首个报道在斑马鱼中通过TALEN成功获得可稳定遗传的斑马鱼突变体的实验室。在这一工作中,我编写了TALEN靶位点预测程序,用于搜索候选的TALEN结合位点;同时还设计了TALEN脱靶位点的预测程序,以及靶位点与脱靶位点高通量测序结果分析平台,辅助分析了针对斑马鱼tnikb基因设计的TALEN定点诱变的效率和用来评估TALEN特异性的脱靶突变的情况。同时,我本人利用这些生物信息学工具,针对一个功能未知的斑马鱼新基因sema3fb设计并构建了TALEN,通过显微注射Mrna的方法将其导入到斑马鱼胚胎内。在注射sema3fb TALEN后的嵌合体胚胎中检测到了高达37％的indel发生效率,且检测到可以稳定遗传的突变。此外,为了在斑马鱼中尝试使用双TALEN实现基因组大片段删除,我针对dusp5基因的第一个和最后一个外显子分别设计构建了TALEN共同注射,以及针对一个在midn基因附近携带有Tbol2转座子插入的转基因鱼系中的Tol2序列设计’TALEN,并同实验室已有的midnTALEN共同注射;均成功在嵌合体胚胎中检测到了大片段删除事件的发生。 在以上工作的基础上,我对涉及EEN(ZFN和TALEN)的信息进行了全面的收集和整理工作,并藉此创建了国际首例EENdb数据库和知识库(http://eendb.zfgenetics.org/)。EENdb中收集了目前所有已报道的针对各个物种基因组设计的ZFN和TALEN,以及跟EEN相关的ZFP和TALE结合结构域、现有公开的EEN构建和筛选资源、跟EEN相关的知识库等信息;同时,在此基础上我还构建了一个基于全基因组搜索程序改造而来的、整合所有ZFN构建方案的ZFN候选靶位点搜索以及ZFP文库构建与筛选的综合性在线解决平台ZFNSiTer(http://eendb.zfgenetics.org/zfnsiter/)。