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第一部分大鼠减体积肝移植术后microRNA表达谱变化背景：活体肝移植术后肝脏再生是影响肝移植预后的关键因素,目前尚未见调控活体肝移植术后肝脏再生的特异性微小RNA (miRNA)的报道。目的：分析miRNAs在大鼠减体积肝移植后各个时间点表达谱的变化,为大鼠减体积肝移植后肝脏再生干预策略提供靶标miRNAs,为临床活体肝移植术后肝脏再生研究提供理论依据。方法：以Kamada的双袖套法为基础建立大鼠减体积原位肝移植模型,和大鼠70%肝切除术模型,利用miRNAs基因芯片技术分别检测两种模型术后12小时、24小时、48小时、72小时、1周等5个时间点miRNAs与假手术组表达谱的差异,分析差异表达miRNAs在大鼠减体积肝移植术后的功能。在差异表达的miRNAs中,通过靶基因预测寻找靶向NM23的目标miRNA。结果：与假手术组大鼠肝组织相比,大鼠减体积肝移植肝脏组织中表达上调的miRNAs有11个,分别为let-7b-5p、let-7c-5p、miR-101a-3p、miR-103-3p、 miR-130a-3p、miR-142-5p、miR-186-5p、miR-199a-3p、miR-21-5p、221-3p、 miR-34a-5p;表达下调的miRNAs有4个miR-26b-5p、miR-150-5p、miR-19a-3p、 rno-miR-146-5p。与假手术组相比,大鼠70%肝切除术后表达上调的miRNAs有let-7b-5p、let-7c-5p、let-7e-5p、miR-101a-3p、miR-103-3p、miR-130a-3p、 miR-199a-3p、miR-221-3p、miR-342-3p等9个,表达下调的有miR-23b-3p、 miR-150-5p。通过靶基因预测软件在大鼠减体积肝移植术后差异表达的niRNAs中找到靶向NM23的miR-199a-3p,再行PCR检测miR-199a-3p各个时间点的表达量,验证miRNAs基因芯片结果是否可信。结论：成功构建大鼠减体积肝移植及大鼠70%肝切除模型,筛选出两种模型差异表达的miRNAs。分析差异表达miRNAs的变化趋势及意义。通过靶基因预测寻找靶向NM23的miR-199a-3p,并验证了芯片结果的可信性。第二部分MiR-199a-3p靶向NM23调控大鼠肝细胞增殖背景：MiR-199a和NM23在肿瘤领域研究较为深入,但在肝脏再生、肝细胞增殖方面的研究尚未见报道。目的：观察miR-199a-3p模拟物及阻遏物在体外培养大鼠肝细胞增殖中的作用,为下一步体内实验奠定理论基础。方法：人工合成miR-199a-3p模拟物,miR-199a-3p阻遏物及其各自阴性对照载体,分别转染SD大鼠BRL-3A肝细胞,实验分四组mimics组、mi-nc组,inhibitors组,in-nc组。转染后12小时、24小时、48小时、72小时通过定量PCR分析各组细胞中NM23、Cyclin D1、PCNA的mRNA变化；转染后24小时、48小时行Western blotting分析比较各组细胞中Cyclin D1、NM23和PCNA蛋白的变化；免疫组化比较NM23、Cyclin D1、PCNA、ki-67阳性细胞比率；流式细胞仪检测各组细胞各周期比例；转染后12小时、24小时、48小时、72小时、96小时用CCK 8法检测细胞增殖。结果：转染后12小时,各组细胞NM23、CyclinD1和PCNA的mRNA含量无统计学差异(P>0.05)；转染后24小时、48小时、72小时,inhibitors组NM23、CyclinD1和PCNA的mRNA含量较in-nc组显著增多(P<0.05),另一方面mimics组的NM23、CyclinD1和PCNA的mRNA含量较mi-nc组显著降低(P<0.05),且以NM23的升高变化最为明显(P<0.01)。转染后48小时、72小时,inhibitors组NM23、CyclinD1和PCNA的蛋白表达量量较in-nc组显著增多(P<0.05),另一方面mimics组的NM23、CyclinD1和PCNA的mRNA及蛋白的含量较mi-nc组显著降低(P<0.05),且以NM23的升高变化最为明显(P<0.01)。免疫组化显示,inhibitors组M23、Cyclin D1、PCNA、ki-67阳性细胞比率均高于mi-nc组(P<0.05),mimics组M23、Cyclin D1、PCNA、ki-67阳性细胞比率均低于mi-nc组(P<0.05)。inhibitors组的GO／G1期细胞比率明显低于in-nc组(P<0.05),mimics组的GO／G1期细胞比率明显高于mi-nc组(P<0.05)。同时,inhibitors组的S期细胞比率明显低于mi-nc组(P<0.05),inhibitors组的S期细胞比率明显低于in-nc组(P<0.05)。CCK-8检测细胞增殖表明inhibitors组的增殖速度明显快于in-nc组(P<0.05), mimics组的增殖速度明显慢于mi-nc组(P<0.05)。结论：靶基因预测软件成功找到靶向NM23的miR-199a-3p。成功合成miR-199a-3p mimics, miR-199a-3p inhibitors及其各自阴性对照载体,并转染SD大鼠BRL-3A肝细。miR-199a-3p inhibitors可以上调NM23表达,促进肝细胞增殖,miR-199a-3p mimics可以下调NM23表达,抑制肝细胞增殖。证实了miR-199a-3p mimics, miR-199a-3p inhibitors在体外培养大鼠肝细胞增殖中的作用。第三部分MiR-199a-3p慢病毒载体对大鼠减体积肝移植术后肝脏再生的影响背景：活体肝移植术后肝脏再生不仅是肝切除导致的肝脏体积减少,还有冷灌注、冷保存、缺血再灌注损伤,术后肝脏再生有其独特性。第二部分实验证实了miR-199a-3p mimics,miR-199a-3pinhibitors通过干预NM23表达调控大鼠肝细胞增殖。目的：通过miR-199a-3p慢病毒载体干预NM23表达观察miR-199a-3p对大鼠减体积肝移植术后肝脏再生的影响。方法：以第一部分所建成功的大鼠减体积肝移植模型为基础,实验分为4个组,miR-199a-3p过表达载体组(OE), miR-199a-3p过表达阴性对照组(OE-NC), miR-199a-3p抑制载体组(IN),miR-199a-3p抑制阴性对照组(IN-NC)。构建上述四种慢病毒载体,分别在术前3天转染至减体积肝移植供体中。术后1天、3天、5天、7天定量PCR检测各组肝组织NM23、PCNA、Cyclin D1的mRNA表达变化情况。术后3天、5天利用蛋白免疫印迹分析检测各组肝组织NM23、 PCNA、Cyclin D1蛋白表达;并用免疫组化检测T4M23、Cyclin D1、PCNA、ki-67阳性细胞比率。检测血清转氨酶,血清胆红素,计算肝脏再生率,绘制生存曲线,研究miR-199a-3p大鼠减体积肝移植术后肝脏再生中的作用。结果：术后1天四组肝组织NM23、PCNA、Cyclin D1的mRNA相对表达量无明显差异(P>0.05)；术后3天、5天、7天等3个时间点IN组三种蛋白mRNA的表达量均高于IN-NC组(P<0.05),OE组三种蛋白mRNA的表达量均低于OE-NC组(P<0.05),差异有统计学意义。术后3天、5天Western blot检测肝组织NM23、PCNA、CyclinD1蛋白的表达,IN组三种蛋白mRNA的表达量均高于IN-NC组(P<0.05),OE组三种蛋白mRNA的表达量均低于OE-NC组(P<0.05),差异有统计学意义；免疫组化显示,IN组M23、Cyclin D1、PCNA、ki-67阳性细胞比率均高于IN-NC组(P<0.05),OE组M23、Cyclin D1、PCNA、ki-67阳性细胞比率均低于OE-NC组(P<0.05),术后第3天至第7天IN组肝脏再生率均明显高于IN-NC组(P<0.05),而OE组肝脏再生率均明显低于OE-NC组(P<0.05)；在术后大鼠血清转氨酶,血清胆红素,生存率,中位生存期等方面,IN组、OE组与各自阴性对照组相比无统计学差异(P>0.05)。结论：成功合成miR-199a-3p过表达载体,miR-199a-3p抑制载体及其各自阴性对照载体,分别转染至大鼠减体积肝移植的供体中。实验发现在大鼠减体积肝移植的供体中miR-199a-3p抑制慢病毒载体上调了NM23的表达,miR-199a-3p过表达慢病毒载体下调了NM23的表达。同时cyclinD1、PCNA、Ki67也随之变化。在NM23、cyclinD1、PCNA、Ki67变化最为显著的时间点,大鼠肝脏再生率也随之变化,说明miR-199a-3p通过干预NM23表达,间接地调控大鼠减体积肝移植术后肝脏再生。