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目的:前期相关临床研究发现清热活血方具有抑制动脉粥样硬化（AS）作用。由单核细胞分化而来的巨噬细胞存在于AS的整个阶段,且巨噬细胞极化在斑块形成的过程中起至关重要作用。本研究通过体内、体外实验,借助高效液相-质谱分析、网络药理学分析、分子对接技术和RNA转录组高通量测序技术,从巨噬细胞极化角度探索清热活血方防治AS的潜在机制,为清热活血方干预动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）提供新靶点和新思路。方法:1.药效研究（1）60只8周龄雄性ApoE-/-小鼠,随机分为空白组,模型组,清热活血方低剂量组,清热活血方中剂量组,清热活血方高剂量组,立普妥组,每组10只。通过给予高脂饮食的方法（16周）构建ApoE-/-小鼠AS模型,并在第8周开始给予相应的药物干预,16周末取材。（2）腹主动脉取血,采用全自动生化分析仪对总胆固醇（Tc）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL-c）及高密度脂蛋白（HDL-c）水平进行检测,评估血脂情况;免疫酶联吸附（ELISA）法检测ApoE-/-小鼠血清中NLRP3、MCP-1、TNF-α炎症因子水平。（3）分离主动脉,通过油红O染色评估脂质沉积情况;HE染色评估斑块大小;高脂饮食对ApoE-/-小鼠损伤成分由天狼星红染色及免疫组化（IHC）法（MOMA-2和α-SMA染色）评估;免疫蛋白印迹（WB）法检测巨噬细胞极化M1（iNOS）/M2（Arg-1）表型表达情况。2.靶点预测（1）采用高效液相-质谱分析方法对清热活血方成分进行定性检测,根据筛选所得成分联合网络药理学分析,预测清热活血方干预AS的信号通路,并通过实时荧光定量（RT-qPCR）法和免疫蛋白印迹（WB）法对信号通路上关键基因和蛋白进行初步验证。（2）清热活血方成分进行定量分析筛选出核心有效成分,并将核心成分与（1）中信号通路上的关键基因进行分子对接,进行核心基因的二次筛选。（3）体外实验,通过细胞计数试剂盒（CCK-8）筛选清热活血方干预RAW264.7细胞的浓度范围,通过加入LPS将巨噬细胞诱导成M1表型巨噬细胞,同时给予不同浓度清热活血方干预。通过免疫荧光（IF）法定性分析巨噬细胞特异性标志物iNOS（M1表型）与Arg-1（M2表型）的表达,实时荧光定量（RT-qPCR）法定量分析巨噬细胞特异性标志物CCR7（M1表型）和CD163（M2表型）的mRNA表达水平,确定清热活血方诱导M1表型巨噬细胞向M2表型极化的最佳浓度。（4）通过细胞水平RNA高通量测序方法得出清热活血方调控巨噬细胞极化的核心信号通路,并对通路上的基因进行实时荧光定量（RT-qPCR）法进行验证筛选差异基因。3.机制验证（1）应用PPRE-driven荧光素酶报告质粒转染,构建抑制质粒;清热活血方联合抑制质粒处理RAW264.7细胞。（2）实时荧光定量（RT-qPCR）法定量检测CCR7（M1表型标记物）和CD163、Fizz-1、Ym-1、Arg-1（M2表型标记物）的mRNA水平.（3）免疫荧光（IF）法定性分析iNOS（M1表型标记物）与Arg-1（M2表型标记物）的表达。（4）免疫酶联吸附（ELISA）法检测细胞上清液IL-1β（M1表型巨噬细胞释放）及IL-4、IL-10（M2表型巨噬细胞释放）细胞因子水平。（5）免疫蛋白印迹（WB）法对通路上的靶蛋白进行验证。结果:1.药效研究（1）ApoE-/-小鼠AS模型构建成功:主动脉油红O染色结果提示,模型组与空白组相比脂质沉积水平显著增加;HE染色中,模型组与空白组相比斑块明显,斑块可见明显的纤维帽。（2）清热活血方可以改善ApoE-/-小鼠AS模型血脂水平、下调炎症因子表达以及发挥稳定斑块作用:全自动生化分析仪检测血脂结果表明,与模型组相比,清热活血方干预组及立普妥组Tc、TG、LDL-c水平降低。ELISA法检测炎症因子水平结果提示,与模型组相比,清热活血方中剂量组、高剂量组及立普妥组NLRP3、MCP-1、TNF-α水平下降,提示清热活血方可以下调炎症因子NLRP3、MCP-1、TNF-α水平。主动脉油红O染色结果提示,清热活血方各组及立普妥组较模型组脂质沉积减少。HE染色中,清热活血方高剂量组、立普妥组与模型组相比斑块明显减小。（3）高脂饮食对ApoE-/-小鼠损伤成分有巨噬细胞参与,机制与巨噬细胞极化相关:免疫组化MOMA-2（巨噬细胞标记物）染色提示,与模型组相比,清热活血方各组及立普妥组MOMA-2含量显著减少。WB法提示,与模型组相比,清热活血方中、高剂量及立普妥组iNOS（巨噬细胞极化M1表型标记物）蛋白相对表达量降低,Arg-1（巨噬细胞极化M2表型标记物）蛋白相对表达量升高。2.靶点预测（1）高效液相-质谱分析方法对清热活血方成分进行定性检测,联合网络药理学分析方法,并通过RT-qPCR法和WB法验证得出,PI3K/Akt可能是清热活血方干预AS的主要信号通路。（2）清热活血方定量分析结果提示,黄芩苷与丹酚酸B可能为清热活血方发挥药效的核心成分;并通过与PI3K/Akt通路上基因的分子对接,发现黄芩苷和丹酚酸B与RXRA基因对接的结合自由能最低。（3）体外实验,清热活血方浓度在5-100μg/ml对RAW264.7细胞的存活率无影响。IF结果提示,iNOS的表达在LPS组阳性率高,清热活血方各组较LPS组阳性率降低,10μg/ml时荧光表达最低;而Arg-1的表达在清热活血方浓度为10μg/ml时阳性率显著升高。RT-qPCR结果显示,CCR7的表达在LPS组较Control组显著升高,在清热活血方浓度为10μg/ml时下降最为显著;CD163的表达在清热活血方各组中表达不同程度上升,其中清热活血方浓度为10μg/ml时最为显著。由此可知清热活血方在浓度为10μg/ml时对巨噬细胞极化调控最为显著。（4）RAW264.7+LPS组与RAW264.7+LPS+10μg/ml QRHX组进行RNA高通量测序,差异表达阈值设定为:|log FC|>1且pvalue<0.05,得到445个差异基因,其中258个下调基因,187个上调基因,通过KEGG分析得到NF-κB等33条信号通路。对NF-κB通路上的16个基因进行实时荧光定量（RT-qPCR）法验证,发现Cxcl3与Ptsg2基因差异最为显著。3.机制验证（1）通过应用荧光素酶报告质粒转染,构建Cxcl3-siRNA,Ptgs2-siRNA和RXRA-siRNA抑制质粒并进行质粒转染成功验证。发现Cxcl3-siRNA,Ptgs2-siRNA和RXRA-siRNA与NC-siRNA相比,mRNA表达显著下降（P<0.01）,提示质粒转染成功。（2）RT-qPCR法提示,与LPS组相比,LPS+Cxcl3-siRNA组、LPS+Ptgs2-siRNA组、LPS+RXRA-siRNA组,巨噬细胞M1表型靶标CCR7水平下调,巨噬细胞M2表型靶标Fizz-1、Ym-1、Arg-1水平不同程度上调,提示在抑制Cxcl3、Ptgs2、RXRA基因后,巨噬细胞向M2表型极化;LPS+Cxcl3-siRNA+10μg/ml QRHX组较LPS+Cxcl3-siRNA组,LPS+Ptgs2-siRNA+10ug/ml QRHX组较LPS+Ptgs2-siRNA组,LPS+RXRA-siRNA+10ug/ml QRHX组较LPS+RXRA-siRNA组,巨噬细胞M1表型靶标CCR7水平下调,巨噬细胞M2表型靶标CD163、Fizz-1、Ym-1、Arg-1水平不同程度上调,提示清热活血方的加入促进了巨噬细胞向M2表型极化。（3）IF法提示,iNOS和Arg-1在RAW264.7胞核和胞浆中表达;LPS+Cxcl3-siRNA+10μg/ml QRHX组较LPS+Cxcl3-siRNA组、LPS+Ptgs2-siRNA+10μg/ml QRHX组较LPS+Ptgs2-siRNA组、LPS+RXRA-siRNA+10μg/ml QRHX组较LPS+RXRA-siRNA组,巨噬细胞M1表型靶标iNOS阳性率降低,提示清热活血方的加入,抑制了巨噬细胞向M1表型极化。LPS+Cxcl3-siRNA+10μg/ml QRHX组较LPS+Cxcl3-siRNA组、LPS+Ptgs2-siRNA+10μg/ml QRHX组较LPS+Ptgs2-siRNA组、LPS+RXRA-siRNA+10μg/ml QRHX组较LPS+RXRA-siRNA组,Arg-1阳性率增加,提示清热活血方的加入促进了巨噬细胞向M2表型极化。（4）ELISA法结果提示,LPS+Cxcl3-siRNA+10μg/ml QRHX组较LPS+Cxcl3-siRNA组,LPS+Ptgs2-siRNA+10μg/ml QRHX组较LPS+Ptgs2-siRNA组,LPS+RXRA-siRNA+10μg/ml QRHX组较LPS+RXRA-siRNA组,巨噬细胞M1表型释放的细胞因子IL-1β水平下调,巨噬细胞M2表型释放的细胞因子IL-4、IL-10水平上调,提示清热活血方的加入抑制了巨噬细胞向M1表型极化,促进了巨噬细胞向M2表型极化。（5）WB法提示,LPS+Cxcl3-siRNA+10μg/ml QRHX组较LPS+Cxcl3-siRNA组,LPS+Ptgs2-siRNA+10μg/ml QRHX组较LPS+Ptgs2-siRNA组,LPS+RXRA-siRNA+10μg/ml QRHX组较LPS+RXRA-siRNA组,PI3K/Akt通路磷酸化蛋白p-PI3K、p-Akt,NF-κB通路磷酸化蛋白p-p50、p-p65,以及PI3K/Akt和NF-κB通路串扰（crosstalk）磷酸化蛋白p-IKK相对表达量下调,提示清热活血方的加入更为有效的下调PI3K/Akt和NF-κB通路关键蛋白的表达,发挥抑制PI3K/Akt和NF-κB通路作用。结论:1.动物实验表明,清热活血方干预ApoE-/-小鼠AS模型,发挥了调脂稳斑、降低炎症因子表达的作用。高脂饮食对ApoE-/-小鼠损伤成分有巨噬细胞的参与,其机制可能与巨噬细胞极化相关。2.清热活血方通过高效液相-质谱定性分析发现68种有效成分,并结合网络药理学分析方法,预测清热活血方发挥抗AS疗效可能通过PI3K/Akt通路实现,得到了基因和蛋白水平上的验证。联合清热活血方定量分析与分子对接技术,提示RXRA基因可能是清热活血方防治AS的核心基因。3.RNA转录组高通量测序结果提示,清热活血方可能通过介导NF-κB通调节巨噬细胞极化从而发挥抗炎作用,Cxcl3和Ptgs2是该通路上的2个关键基因。4.细胞实验表明,清热活血方具有促进巨噬细胞向M2表型极化和降低炎症因子表达作用,其具体机制可能通过抑制PI3K/Akt和NF-κB通路实现。5.清热活血方可能通过抑制PI3K/Akt和NF-κB信号通路调节巨噬细胞向M2表型极化从而抑制炎症反应,发挥抗AS作用。