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结核病(Tuberculosis,TB)是一种高发病率和高传染性的疾病,主要是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起。2013结核患病人数900万有150万人死于此病。2015年结核病新增人数960万,较2013年有增长趋势;在我国耐药结核在所报道的TB病例中所占比例较大,结核分枝杆菌耐药性问题已成为国内外结核病防治工作者关注的焦点之一。形成生物被膜是细菌耐药的重要机制之一,结核分枝杆菌能够在体内外形成生物膜,而这些生物膜内的菌体在高浓度抗生素作用下依然能够生存。已有报道表明,胞外DNA(Extracellular DNA,e DNA)和自溶素基因在生物被膜形成过程中起着关键的作用,而自溶素基因和肽聚糖水解酶密切相关。结核分枝杆菌Rv3915基因和耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,M.smegmatis)中MSMEG_6935(统称cwl M基因)分别编码各自菌体的CwlM蛋白,结核分枝杆菌的CwlM(简称CwlMTB)和耻垢分枝杆菌的CwlM(简称CwlMms)是肽聚糖水解酶的酰胺酶,能够水解细菌细胞壁。鉴于CwlM具有水解细菌细胞壁的作用,临床应用的潜在价值巨大,故CwlM对细菌自溶和生物被膜的影响能力值得深入研究。在本研究中,我们成功构建了耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌的体外生物被膜模型,通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测cwl M基因分别在MTB和M.smegmatis生物被膜中的表达;原核表达和纯化结核分枝杆菌CwlMTB和耻垢分枝杆菌CwlMms蛋白,探讨重组CwlMms和CwlMTB分别对各自菌体的自溶和生物被膜形成表型的影响;最后通过构建耻垢分枝杆菌的cwl M缺失株进一步来确证内源CwlMms对其自溶和生物被膜的影响。首先,采用q RT-PCR实技术,分别检测了耻垢分支杆菌MSMEG_6935基因和结核分枝杆菌中Rv3915基因在生物被膜形成过程中的表达情况。结果显示,MSMEG_6935基因在耻垢生物被膜形成中期表达量比浮游状态极显著上调(上调3倍,p0.001);生物被膜成熟期,MSMEG_6935基因表达量较浮游菌显著下调(p0.01);Rv3915基因在结核生物被膜生物被膜形成早期,表达量较浮游菌无显著差异(p0.05);在生物被膜形成的中期和成熟期,Rv3915基因表达量较浮游菌极显著增加(p0.001)由此推断cwl M基因在生物被膜形成过程中起到一定的作用。其次,利用原核表达系统对结核分枝杆菌CwlMTB和耻垢分枝杆菌CwlMms蛋白分别进行大量表达。本实验成功构建了pcold-6935和pcold-3915表达质粒;获得了pcold-6935-plys和pcold-3915-plys表达菌株;通过0.1 m M IPTG低温诱导,成功表达了具有生物活性的可溶性蛋白。通过亲和层析,离子交换层析,凝胶过滤层析等技术进行蛋白分离纯化;通过SDS-PAGE和Western Blot(WB)分别检测和验证蛋白纯化结果。结果显示:CwlMms和CwlMTB蛋白条带比较单一,纯化所得蛋白为可溶性目的CwlMms和CwlMTB。CwlMms最终蛋白得率约为5 mg/L,CwlMTB得率约为5 mg/L。再次,进一步研究了重组CwlMms和CwlMTB分别对耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌自溶和生物被膜形成的影响。通过测定重组CwlMms蛋白处理和对照组的Mc2155细菌悬液在0.1%Triton X-100的OD580nm变化值检测自溶能力;通过测定重组CwlMTB处理组和对照组的H37Rv培养基中异柠檬酸脱氢酶活性来检测自溶的程度;通过结晶紫定量测定重组CwlMms对耻垢生物被膜的影响和重组CwlMTB对结核生物被膜的影响。结果表明:CwlMms处理增强了耻垢分枝杆菌Mc2155的自溶能力;CwlMTB处理增强了结核分枝杆菌H37Rv的自溶能力;CwlMms显著降低耻垢生物被膜的产量(p0.001);CwlMTB对结核生物被膜有抑制作用(p0.05)。最后,通过构建耻垢分枝杆菌的cwl M基因缺失株验证内源CwlM对耻垢分枝杆菌自溶和生物被膜形成的影响。通过利用p PR27温敏性穿梭质粒进行同源重组,我们进行cwl M基因缺失株(MSΔ6935)的构建;通过测定0.1%Triton X-100诱导下Mc2155和MSΔ6935的自溶能力;通过扫描电镜图和荧光显微镜来观察cwl M基因缺失对耻垢生物被膜的两种标志物e DNA和e RNA的影响,观察cwl M基因缺失对生物被膜产量影响。结果表明:筛选到具有卡那基因抗性的菌落,说明cwl M基因缺失株(MSΔ6935)构建成功;对比实验结果显示MSΔ6935菌株较其亲代Mc2155菌株的自溶能力减弱;MSΔ6935比Mc2155的e DNA和e RNA含量减少,说明耻垢分支杆菌CwlMms的编码基因MSMEG_6935缺失会显著降低耻垢生物被膜的产量。总之,cwl M基因在结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌的生物被膜形成过程中差异表达;重组的CwlMTB和CwlMms分别促进各自菌体的自溶;重组CwlMTB和CwlMms对结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌各自的生物被膜形成有抑制作用。基因敲除实验确证cwl M基因缺失导致耻垢分枝杆菌自溶能力和生物被膜形成能力减弱。本研究为肽聚糖水解酶作为新药物标靶的筛选,以及利用肽聚糖水解酶和核酸抑制剂来联合开发抗细菌生物被膜药物提供了理论基础。