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目的：
眼部新生血管的发生机制尚未完全阐明，研究发现新生血管形成是一个复杂的过程，受一系列分子信号的调控，生理条件下促进血管生成的因子和抑制血管生成的因子处于动态平衡。当促血管新生因子增加和/或抑制血管新生因子减少时，导致新生血管形成。临床上对于眼部新生血管疾病的治疗或是由于非选择性的损伤周围正常组织，或是由于未能消除根本病因而容易复发，都不能达到满意的治疗效果。近年来许多学者尝试采用生物学方法治疗血管新生，如拮抗血管新生促进因子的作用，或加强血管新生抑制因子的作用，从血管新生的分子基础着手，阻断新生血管发生、发展的中间环节，从而提出了防治新生血管的新途径。
在血管发生中，有三种重要的受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)参与其中，分别是血管内皮生长因子及其受体(VEGF/VEGFR)系统、血管生成素/Tie受体系统以及Ephrin/Eph受体系统。其中Eph受体是新发现的RTK家族中最大的分支， Eph和其它RTKs不同的是，受体和配体均发生磷酸化，从而介导双向的信号传递。目前关于血管新生Eph受体的发生机制以及新疗法的开发受到越来越多学者的关注，尤以EphB4受体研究较多。Shikun He等应用体外重组的可溶性单体形式sEphB4玻璃体腔内注射后使激光诱导的牛脉络膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）的面积和渗透率大大下降，另有文献报告可溶性嵌合体EphB4-Fc也可以抑制小鼠CNV和视网膜新生血管(retinalneovascularization，RNV)的形成，而基于肿瘤的一些研究也表明sEphB4可以抑制肿瘤的生长和血管发生。以上实验结果似乎与反向信号理论相悖，但提示我们EphB4受体可能在眼部血管新生方面起到重要的调节作用。
参与眼部新生血管形成的细胞因子主要有血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowth factor，VEGF)、色素上皮源性因子(pigmentepithelium-derived factor, PEDF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growthfactor，bFGF)、血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)、转化生长因子(transforming growth facto，TGF)等。其中，VEGF和PEDF被认为是血管新生过程中主要的促进因子和抑制因子，而bFGF是最早在视网膜中发现的几乎作用于新生血管形成每一环节，具有强烈的促血管生成作用，在新生血管的发生与发展中起重要作用。为迸一步明确EphrinB2/EphB4系统在眼部血管新生过程中所起的作用以及进一步探讨EphrinB2/ EphB4系统是否影响VEGF、bFGF、PEDF三种因子的表达，我们采用激光击破Bruch膜建立小鼠实验性CNV模型以及应用高氧诱导建立小鼠实验性RNV模型，观察玻璃体腔内注射EphB4单克隆抗体对实验性CNV和RNV发展的影响，并应用RT-PCR半定量测定两种模型实验组和对照组脉络膜组织以及视网膜组织中VEGF、bFGF、PEDFmRNA表达水平变化，从而对EphB4单克隆抗体可能的作用机制进行探讨，为眼部新生血管疾病的生物学治疗提供新的线索和依据。
实验方法：
第一部分:(1)选用7周龄健康C57BL/6J母鼠，采用氩激光击射的方法建立实验性CNV模型。击射部位（每只眼击射4处）均有气泡产生的鼠眼入选本实验（共54只眼）。随机选取27只鼠眼归入实验组，分别在实验性CNV模型建立的0，3，6，9天玻璃体腔注入1μl EphB4单克隆抗体0.1μg;27只鼠眼归入对照组，在相同时间点玻璃体腔注入等量平衡盐溶液(BSS);(2)造模后10天，取实验组和对照组各9只鼠眼36处光斑，行FITC-dextran灌流脉络膜铺片检查，于荧光显微镜下观察、照相。同时应用MacScope软件测算每个光斑处实验性CNV的面积，计算各组平均值;(3)实验组和对照组各9只鼠眼36处光斑students test组织病理学检查，光镜观察、照相，同时应用每个光斑处实验性CNV的最大厚度（光斑中心脉络膜底部与新生血管膜顶点之间的距离，M）与周围正常脉络膜厚度(C)的比值，计算各组平均值;(4)取实验组及对照组每组各9只眼，每3只眼脉络膜组织充分混匀后分别进行VEGF、PEDF以及bFGFmRNA的RT-PCR的测定。对PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分析。应用凝胶图像分析软件进行吸光度(A)半定量mRNA水平检测，结果以内参照GADPH标准化。
第二部分:(1)选用生后7天C57BL/6J小鼠30只利用高氧诱导建立实验性视网膜新生血管（RNV）模型，每只小鼠随机选取一眼归入实验组，在生后12d和14d麻醉后玻璃体腔内注射1μl EphB4单克隆抗体0.1μg，对侧眼归入对照组，在相同时间点注入等量BSS;(2)生后17天，取实验组和对照组各10只鼠眼行FITC-dextran灌流视网膜铺片检查，荧光显微镜下观察、照相，并应用MacScope软件测量视网膜中央血管无灌注区的面积;(3)生后17天取实验组和对照组各8眼，制作冰冻切片，免疫组化切片计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核的数目;(4)取实验组及对照组每组各12只眼，每4只眼视网膜组织充分混匀后分别进行VEGF、 PEDF以及bFGFmRNA的RT-PCR的测定。对PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分析。应用凝胶图像分析软件进行吸光度(A)半定量mRNA水平检测，结果以内参照GADPH标准化。
实验结果：
第一部分:(1) FITC-dextran灌流脉络膜铺片检查证实光凝10天后实验组和对照组光斑处均可见CNV，具体表现为由扁平血管组成的网状结构，较宽大，而实验组光斑处新生血管网面积较小，有的仅表现为血管环。CNV面积定量分析显示对照组平均为(28.12±3.79)×10-3mm2，实验组平均为(19.19±2.48)×10-3mm2，实验组CNV明显受到抑制(t=11.84，P＜0.01);(2)组织病理学检查实验组的CNV较薄、较小，测量CNV厚度比值的定量分析显示对照组为2.60±0.63，实验组为1.74±0.28，实验组的CNV的发展明显受到抑制(t=7.45，P＜0.01);(3) RT-PCR检测分析显示:实验组小鼠脉络膜VEGFmRNA表达明显低于对照组(t=12.49，P＜0.01)、bFGFmRNA表达亦明显低于对照组(t=2.92，P＜0.05)，而PEDF mRNA的表达则显著高于对照组(t=-6.17，P＜0.01)。
第二部分:(1)视网膜铺片检查显示对照组和实验组视盘周围的后极部血管闭塞，呈现无灌注区，周边部血管灌注大致正常，RNV主要发生在两者交界处;与对照组相比，实验组血管迂曲及不规则扩张明显减轻，新生血管丛明显减少，血管无灌注区范围更大，分别为（21.56±3.10）％和（31.03±7.39）％(t=-3.74，P＜0.01)，提示EphB4单克隆抗体加重OIR缺血;(2)免疫组化切片RNV内皮细胞核计数显示对照组有大量RNV突破视网膜内界膜向玻璃体腔生长，而实验组玻璃体腔侧RNV明显减少，内皮细胞核分别计数为27±10和16±6，两者差异有统计学意义(t=9.68，P＜0.01);(3) RT-PCR检测分析显示:实验组小鼠脉络膜VEGFmRNA表达明显低于对照组(t=7.18，P＜0.01)、bFGFmRNA表达亦明显低于对照组(t=4.08，P＜0.05)，而PEDF mRNA的表达也显著低于对照组(t=4.40，P＜0.05)。
结论：
EphB4单克隆抗体玻璃体腔注射可明显抑制实验性CNV和实验性RNV的形成，其作用机制可能主要是干扰了双向信号理论中的反向信号，导致血管构型重塑障碍，也可能是通过影响其它血管因子的表达而对血管形成发生作用。虽然机制尚不清楚，但内源性的EphrineB2/EphB4可以调节眼部新生血管的发生，都将是老年黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）和早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity，ROP)治疗干预的有用靶点。