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1研究背景和目的宫颈癌(Cervical Carcinoma)是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤，在全球女性恶性肿瘤中占第二位，仅次于乳腺癌，每年全球新增宫颈癌病例约49万多例，其中80％在发展中国家。其预后与临床分期密切相关，中晚期患者5年生存率仅为10％左右，而早期患者5年生存率则可达到90％以上。宫颈癌的复发和转移不仅与临床分期有关，同时亦与临床治疗方案密切相关。如何提高早期诊断率、正确制定治疗方案和评价治疗效果、估计预后以及预防复发显得优为重要，也是本研究的目的。宫颈上皮组织的癌变过程是一个多阶段进行性过程，经历了宫颈上皮内瘤变(Cervical Intraepithelial Neoplasia，CIN)，包括CINⅠ级：轻度不典型增生；CINⅡ级：中度不典型增生；以及CINⅢ级：重度不典型增生和原位癌。宫颈上皮内瘤变是与宫颈浸润癌密切相关的一组癌前病变，它反映了宫颈癌发生发展中的连续过程。在这个过程中可有逆向性转变，而且每个阶段大约要经历5-10年的时间，是宫颈癌的预防及早期诊断和治疗的理论基础和依据。在宫颈癌的致病因素中，研究最多的是人乳头状瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染，研究表明高危型HPV感染是宫颈癌发生发展中的重要因素，然而单纯的HPV感染不足以引起宫颈癌的发生，HPV感染是宫颈癌发生的基础，加之其它因素如：不良性行为等共同作用下，最终导致宫颈癌的发生。从生物学的角度而言，在宫颈癌发生发展过程中存在多个基因的表达异常。人类染色体中的遗传信息的传递需经转录合成mRNA，再经翻译过程得到相关的蛋白质而实现，也就是说实现基因功能表达的最终物质是蛋白质，因此，直接测定蛋白质的水平和活性是了解细胞活动的最好办法。近年来一种新的可高通量检测血清或组织中的蛋白质技术，表面加强激光解吸电离飞行时间质谱(surface-enhanced laser desorption／ionization-time of flight-mass spectrometry，SELDI-TOF-MS)，发展迅速，这一技术不但可高通量检测蛋白质，而且结合生物信息学技术还可得到用于样本分类的蛋白质组合，标本可用少量甚至微量的血清、组织等，目前已广泛应用于临床肿瘤的研究，如消化系统、呼吸系统以及泌尿生殖系统的恶性肿瘤。但对于宫颈癌的研究报道甚少，用宫颈癌组织做标本进行此项研究的报道有一家，而用血清做标本进行宫颈癌研究的目前尚未见报道。为了能够建立用于宫颈癌和癌前病变的诊断与宫颈癌筛查的血清蛋白质组合，进一步了解宫颈癌的发生机制，本研究采用SELDI-TOF-MS技术对宫颈癌与健康女性的血清蛋白质质谱变化进行研究，进行差异表达的蛋白质筛选，然后在宫颈癌前病变患者、宫颈癌行广泛子宫切除加盆腔淋巴结清扫术后以及其后进行随访的患者血清中，进行同组蛋白质含量的t检验，以了解它们在无瘤—有瘤—无瘤生存模式全过程中的变化，以期筛选出能够监测宫颈癌全过程的蛋白质组合，如宫颈癌的早期诊断、治疗效果的评价以及预后的评估。2材料与方法2．1研究对象样本来自郑州大学第一附属医院，入选要求：病理资料完整，无放疗或化疗等针对宫颈癌的治疗。2．1．1血清标本①宫颈癌49例，其中鳞癌45例(91.84％)，腺癌4例(8.16％)：FIGO分期Ⅰb-Ⅱa期39例(79.59％)，Ⅱa期以上10例(20.41％)。中位年龄47岁(25岁-75岁)。以及年龄相配的健康女性71例。②宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)67例，其中CINⅠ-Ⅱ级35例，CINⅢ级32例。③宫颈癌Ⅰb—Ⅱa期行广泛子宫切除和盆腔淋巴结清扫手术后10天者24例，术后3月复诊者22例，术后1年随访者18例。2．1．2组织标本宫颈癌组织33例，正常宫颈上皮组织29例。2．2标本收集2．2．1血清标本清晨空腹静脉血3ml，静置30min，2000rpm，离心20min，每管100μl分装，-80℃冰箱保存。2．2．2组织标本宫颈癌行广泛子宫全切加盆腔淋巴结清扫手术，标本离体后立即剖开宫颈，清理宫颈黏液，靠近癌组织基底部取材，同时在距癌组织边缘≥1cm处选取正常宫颈上皮，初步切碎后用0.25％胰蛋白酶消化30分钟，Hank’s液冲洗，900rpm离心10min，去除上清夜，重复冲洗离心共3次，行细胞涂片常规病理检查，同时行细胞记数，要求目标细胞(正常宫颈上皮细胞或宫颈癌细胞)≥85％，细胞计数1×10~7／ml，做好标记，置于-80℃保存。2．3研究方法2．3．1芯片准备将IMAC-Cu芯片(immobilized metal affinity capture arrays-Cu，IMAC-Cu)置于操作平台，每孔加50μl 100mmol／L硫酸铜，振荡5min，倒除硫酸铜，去离子水冲洗5次，甩干；每孔中加入50μl的100mmol／L醋酸钠(PH4．0)使之中和，振荡5min，去离子水冲洗5次，甩干；每孔加入结合缓冲液150μl(pH7．0)使之平衡，振荡器震荡5min后除去缓冲液，重复一次。2．3．2血清样本的处理样本冰盒上融化，以10μl血清加20％μl(1：2)的比例加入U9缓冲液混匀，4℃震荡30min，使蛋白质变性，取10μl变性后的样品加120μl的结合缓冲液，4℃震荡30min备用。2．3．3组织样本处理样本冰盒上融化，加入50μl细胞裂解液，4℃震荡30min，15000rpm，4℃离心10min，取上清夜20μl，以1：2的比例加入U9缓冲液，4℃震荡30min，使蛋白质变性，取10μl变性后的样品加120μl的结合缓冲液，4℃震荡30min备用。2．3．4蛋白质结合反应在处理好的芯片中每孔加入50μl处理好的样品(血清／组织)，4℃震荡60min；每孔加入150μl结合缓冲液，振荡5min，弃去缓冲液，重复操作一次；每孔分两次加入能量吸收分子饱和溶液，每次0.5μl，两次之间允许各孔风干。2．3．5数据收集和生物信息学处理将芯片放入质谱阅读仪检测，在ProteinChip software(Ciphergen，Inc)支持下，设定读片程序。在样本芯片阅读检测前，用加有All-in-one标准蛋白质的NP20芯片校正质谱仪，使分子量检测误差＜0.1％，再以质控蛋白芯片做重复性检测，质谱峰值强度(高度)的变异系数控制在15％以下。设定SELDI-TOF-MS激光强度为170，诊断率为6，优化分子量范围为2000—20000Da，最高分子量为50，000Da，行低、高能量两次检测，平均收取90个激光点。利用Biomarker Wizard Software(类似统计学软件)进行噪音过滤以及统计学分析，组间相同质荷比(mass to charge，M／Z)的蛋白质峰平均强度值做组间t检验，得出该蛋白质在两样本之间表达的差异。采用Biomarker Patterns Software(数据挖掘软件)建立决策树分类模型，即：将初步筛选出的蛋白质质谱信息资料输入这个软件系统，软件读取，建立最大决策树分类模型及源于该模型的较小决策树，决策树会依据质谱峰强度的不同将样本分到不同的两个节点内，而后每一个节点内的样本又会根据一个新的质谱峰的强度值再分类，当一个样本中的质谱峰强度小于或等于这个选定的阈值时，就被分到左边的节点内，否则分到右侧，直到所有输入的样本都被分到终节点为止，进入模型分类时错误率最低的质谱峰被选为分类变量。用10倍交叉验证(10-fold cross validation)方法对决策树进行验证，找出错误率最低的决策树分类模型，同时得到该分类模型对样本的诊断率(敏感度)和排除率(特异度)。2．3．6差异表达蛋白质的t检验将从宫颈癌患者与健康女性血清中筛选出的具有分类意义的差异表达蛋白质作为一组，同其从CINⅠ-Ⅱ级、CINⅢ级、宫颈癌手术治疗后以及其后随访各组的SELDI-TOF-MS检测中得到的原始数据进行t检验(SPSS 11．0)3结果3．1宫颈癌患者与健康女性血清蛋白质质谱分析及分类意义蛋白质的筛选宫颈浸润癌患者与正常对照组中，共有47种蛋白质质谱峰强度差异有显著性(P＜0.01)，其中具有诊断分类价值(分类权重在95％以上)的蛋白质有6种，其M／Z为(以相对分类权重排序)：M8929.31，M7930.52，M9127.31，M8141.01，M7963.06，M9280.63，它们的相对分类权重分别为：100、98.25、98.25、98.12、97.35和97.00。这6种蛋白质在宫颈癌患者中全部为低表达，其平均含量在正常对照组明显高于宫颈浸润癌患者(P＜0.01)。M／Z为M8929.31的蛋白质被自动作为分类变量建立的决策树分类模型，敏感性为97.96％(48／49)，特异性为98.59％(70／71)。3．2 6种蛋白质在宫颈癌前病变血清中的变化与健康女性相比，在宫颈癌前病变中存在多种蛋白质的表达异常，包括从宫颈癌患者与健康女性血清中筛选出的M／Z为M8929.31，M7930.52，M9127.31，M8141.01，M7963.06，M9280.63的6种差异表达蛋白质。这6种蛋白质在宫颈癌前病变中的含量明显高于宫颈癌，而低于正常健康女性，含量由正常对照、CINⅠ-Ⅱ级、CINⅢ级、宫颈癌依次依P＜0.01水平降低。3．3 6种蛋白质在宫颈癌术后及随访患者血清中的变化3．3．1 6种蛋白质在宫颈癌术后第十天时血清中的变化宫颈癌行广泛子宫切除加盆腔淋巴结清扫手术治疗后的第十天，除M／Z为M9280.63的蛋白质含量较手术前无明显差别外(0.6307±0.5789／0.4084±0.3098，P=0.083)，M／Z为M8929.31，M7930.52，M9127.31，M8141.01和M7963.06的蛋白质含量则较手术前明显回升(P＜0.01)，但与健康女性相比仍有较大差距(P＜0.01)。3．3．2 6种蛋白质在宫颈癌术后3月时血清中的变化宫颈癌在手术治疗后3月复诊时，M／Z为M8929.31，M7930.52，M9127.31，M8141.01，M7963.06，M9280.63的6种差异表达蛋白质的含量，继续回升，明显高于手术后第十天时的水平(P＜0.01)，包括M／Z为M9280.63的蛋白质。3．3．3 6种蛋白质在宫颈癌术后1年时血清中的变化M／Z为M8929.31，M7930.52，M9127.31，M8141.01，M7963.06，M9280.63的6种差异表达蛋白质的含量，在手术治疗后的1年内的时间里继续回升，与手术后3月复诊时的水平相比明显升高(P＜0.01)。与健康女性相比，M／Z为M8929.31的血清蛋白质含量尚未恢复正常(11.9831±8.1697／19.88395=13.3494，P=0.003)，M／Z为M7930.52，M9127.31，M8141.01，M7963.06，M9280.63的血清蛋白质含量均已恢复正常，已无统计学意义(P＞0.05)。3．4宫颈癌组织与正常宫颈上皮中蛋白质质谱的变化宫颈癌细胞与正常宫颈上皮细胞对照共有72种蛋白质质谱峰强度值比较差异有显著性(P＜0.01)，有分类意义的蛋白质有8种，质荷比为：M5929.87，M3630.52，M10335.39，M6793.00，M7365.78，M4498.06，M8856.45，M9586.27，其中M5929.87，M3630.52，M10335.39，M6793.00，M7365.78，M4498.06，在宫颈癌组织中低表达，M8856.45，M9586.27在宫颈癌组织中高表达。用M5929.87，M3630.52和M10335.39建立的决策树分类模型的敏感性为93.94％(31／33)，特异性为96.55％(28／29)。4结论4．1宫颈癌和健康对照组血清蛋白质资料分析质荷比为M8929.31，M7930.52，M9127.31，M8141.01，M7963.06，M9280.63的一组蛋白质与宫颈癌的发生密切相关，在宫颈癌患者血清中低表达，推测它们可能是正常宫颈上皮的具有生理功效的一组蛋白质或多肽，也可能是一组重要的保护因素或抑癌因子。这组蛋白质的表达变化，反映了宫颈癌的重要特征性分子学改变，有可能成为与宫颈癌相关的重要生物学标记物。4．2宫颈癌前病变组血清蛋白质资料分析质荷比为M8929.31，M7930.52，M9127.31，M8141.01，M7963.06，M9280.63的一组蛋白质含量，由正常对照、CINⅠ-Ⅱ级、CINⅢ级到宫颈癌，依次依P＜0.01水平降低，推测它们与宫颈癌的发生发展密切相关，验证了它们可能是正常宫颈上皮的具有生理功效的一组蛋白质或多肽，也可能是一组重要的保护因素，或抑癌因子。提示：经过更多的资料补充和研究后可成为用于宫颈癌前病变的筛选以及宫颈癌早期诊断的一组生物学指标。4．3宫颈癌术后及随访组血清蛋白质资料分析质荷比为M8929.31，M7930.52，M9127.31，M8141.01，M7963.06和9280.63的一组蛋白质，其含量在宫颈癌手术治疗后逐渐回升，在手术后1年内的时间里基本恢复至正常水平，提示：经过大样本随访资料补充和宫颈癌治疗后复发及转移患者此组血清蛋白质含量的比较研究，有可能成为制定宫颈癌治疗方案的依据、评价宫颈癌治疗效果以及判断预后使用的一组生物学指标。4．4宫颈癌组织与正常宫颈上皮组织资料分析利用SELDI-TOF-MS技术从宫颈癌组织和正常宫颈上皮组织中筛选出的具有分类意义的8种蛋白质，经过进一步研究以及与宫颈癌血清蛋白质质谱技术共同应用，有可能筛选出更为简单实用能够应用于临床的免疫组化指标。4．5本研究资料的综合分析质荷比为M8929.31，M7930.52，M9127.31，M8141.01，M7963.06和9280.63的一组蛋白质，其血清含量由健康女性、CINⅠ-Ⅱ级、CINⅢ级到宫颈癌，依次依P＜0.01水平降低，至宫颈癌时降低到最低水平，在宫颈癌手术治疗后逐渐回升，在手术后的1年时间里基本恢复至正常水平。撇开它们在宫颈癌分子水平研究中的作用与地位，如果经济允许，可将它们从蛋白质数据库中查出对应的蛋白质，然后进行进一步的蛋白质检测与鉴定，同时进行大样本的测试，并增加宫颈癌治疗后的复发和转移患者此组血清蛋白质的监测，以及进行生存资料的完善与补充，相信能够将本研究用于临床，更希望简单、快捷的试剂盒会问世。