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microRNAs(miRNAs)是一类广泛存在于真核生物中长度约22nt、高度保守的小分子非编码RNA,通常与其靶基因mRNAs的3’UTR区域结合而导致mRNAs降解或抑制其转录后翻译,其几乎参与所有的生物学功能调控。骨骼肌约占个体重的30-40%,是机体新陈代谢的活动中心,也是肉用动物的主要经济性状之一。但是,目前对于miRNAs在骨骼肌发育过程中的表观调控机制还不太清楚。本实验室基于前期高通量测序结果,发现miR-10b-5p在猪骨骼肌中表达量较高,但miR-10b-5p对骨骼肌发育的影响及其调控机制还未见报道。因此,本试验运用C2C12成肌细胞作为研究模型,通过过表达或抑制表达miR-10b-5p来探究其对成肌细胞增殖、分化及迁移的影响作用。并进一步通过双荧光素酶报告系统和小干扰RNA技术验证miR-10b-5p的靶基因以及作用的下游调控网络,明确miR-10b-5p在调控成肌细胞增殖和分化的遗传调控过程中的作用。主要研究结果如下:(1)miR-10b-5p在心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉、脂肪组织中均有表达,并且肌肉组织中的表达量相对较高。同时,miR-10b-5p的表达量存在一定的时序性,其表达水平在C2C12成肌细胞的增殖过程中逐渐下降,而在其分化过程中显著升高。(2)根据用于测定细胞增殖能力的CCK8和EdU试剂盒测定结果,发现miR-10b-5p能够显著促进C2C12成肌细胞的增殖能力(P<0.01)。在此过程中,miR-10b-5p显著地促进了细胞周期蛋白相关基因表达(CDK4、CyclinE、CyclinD1、CyclinB)(P<0.01)。(3)通过MyHC免疫荧光染色试验发现miR-10b-5p能够显著抑制成肌细胞的肌管生成(P<0.01),进而降低其成肌分化能力。在此过程中,miR-10b-5p显著地抑制了肌源性分化标志基因(MyHC、MyoD、MyoG、Myf5、MRF4)的表达(P<0.01)。(4)通过细胞划痕试验发现,miR-10b-5p能够显著促进C2C12成肌细胞的迁移能力(P<0.01)。在此过程中,显著地促进了成肌细胞迁移相关功能基因(Pax3、Fhl1和Actg1)的表达(P<0.01)。(5)通过双荧光素酶报告系统的试验结果证明NFAT5和E2F7是miR-10b-5p的直接靶基因。干扰NFAT5的表达,显著抑制了成肌细胞的肌管生成(P<0.01)。而干扰E2F7的表达,则显著地促进了成肌细胞增殖(P<0.01)。上述研究结果表明miR-10b-5p能够促进C2C12成肌细胞的增殖及迁移,同时抑制成肌细胞分化。miR-10b-5p通过直接靶向E2F7和NFAT5调控肌生成相关的增殖和分化过程。这些研究结果表明miR-10b-5p是肌生成过程中的一种重要的表观调控因子与肌肉表型密切相关,本研究为肌肉发育的表观遗传调控研究提供了基础数据。