论文部分内容阅读
背景:爆发性肝损伤又称为急性肝衰竭,是由病毒性肝炎、药物和毒素等多种病因引起的急危重症。该病起病急、进展迅速、生存率低,表现为短期内肝细胞大量坏死和肝功能明显降低。随着病程发展,ALF甚至可累及多个器官和系统,出现门静脉高压性出血、脑水肿、肝性脑病、凝血功能障碍、肾功能障碍和呼吸功能障碍。然而,目前仍然难以预测ALF的发生发展,并且药物治疗或肝移植仍不能挽救一些患者的生命。因此迫切需要进一步研究ALF的发病机制来帮助改善临床诊断和治疗方案。作为重要的天然免疫器官,肝脏中包含了多种天然免疫细胞。它们聚集在肝脏中,为机体抵御病原入侵提供免疫保护。然而,免疫细胞的过度活化,可诱导炎症因子风暴,对肝细胞产生出乎意想的自身攻击,引起自身免疫性的肝组织损伤。实现这些天然免疫应答的关键在于免疫细胞相关蛋白对保守的微生物相关分子模式的相互识别和作用。其中NOD2受体作为胞内模式识别受体NLRs（NOD-like receptors）家族的重要成员,可感应和结合病原菌或肠道共生菌细胞壁成分肽聚糖降解产物胞壁酸酰二肽（Muramyldipeptide,MDP）,从而引起免疫细胞的活化。已有的研究表明,NOD2受体与机体多种炎症性疾病密切相关。在肝脏中,多种免疫细胞和肝实质细胞均表达NOD2受体,但NOD2受体与肝脏疾病的关系及作用的研究还相对较少,是值得探讨的方向。在研究NOD2受体在肝损伤中的作用机制时,建立基于NOD2受体的爆发性肝损伤动物模型显得尤为重要。本研究中,我们参考以往构建动物模型时利用D-Gal N预先致敏肝脏的方法,尝试通过NOD2配体L18-MDP联合肝致敏剂D-Gal N建立一个新的爆发性肝损伤动物模型,从而探索天然免疫细胞在肝脏损伤中的免疫作用及机制。方法:1.称取体重匀称的小鼠,分为空白对照组、静脉注射L18-MDP（10ug/只）处理组、腹腔注射D-Gal N（20mg/只）处理组、L18-MDP（10ug/只）/D-Gal N（20mg/只）联合处理组。在干预16h后,利用赖氏法检测血清转氨酶ALT水平,并结合H&E染色观察肝脏病理学改变和综合评估肝组织损伤的严重程度。此外,结合其他脏器H&E染色评估该损伤的肝脏相对特异性。2.通过流式细胞技术检测空白对照组和联合处理组小鼠肝脏NK、NKT、CD4+T和CD8+T细胞亚群的比例、活化状态以及细胞因子IFN-γ的分泌功能。3.利用脂质体预先清除体内Kupffer细胞,同时对照组注射等体积的PBS,48h后,联合注射L18-MDP/D-Gal N诱导两组的ALF。结合血清转氨酶ALT水平和H&E染色显示的肝脏病理学变化,探讨Kupffer细胞对L18-MDP/D-Gal N诱导的肝损伤的影响。4.通过流式细胞技术检测联合注射后肝脏中性粒细胞的比例和数目,探讨联合注射对中性粒细胞在肝脏中聚集的影响。利用脂质体预先清除体内Kupffer细胞,通过流式细胞技术检测肝脏中性粒细胞的比例和数目的变化,探讨Kupffer细胞对中性粒细胞在肝脏中聚集的影响。5.利用实时定量PCR法和酶联免疫吸附试验（ELISA法）检测联合注射后小鼠肝脏和血清中肿瘤坏死因子（TNF）-α的变化。利用MP6-XT3抗体预先中和体内TNF-α,同时对照组注射等体积的PBS,30min后,联合注射L18-MDP/D-Gal N诱导两组的ALF。结合血清转氨酶ALT水平和H&E染色显示的肝脏病理学变化,探讨细胞因子TNF-α对L18-MDP/D-Gal N诱导的肝损伤的影响。利用脂质体预先清除体内Kupffer细胞后通过ELISA法检测血清中TNF-α的变化,探讨Kupffer细胞作用的分子机制。结果:1.L18-MDP/D-Gal N联合注射后小鼠血清ALT水平明显升高、大片肝组织坏死,但单独注射L18-MDP或D-Gal N不能引起明显的肝损伤。此外,L18-MDP/D-Gal N联合注射对小鼠的肺、肾、小肠和结肠均无明显损伤。2.联合注射后小鼠肝脏中NK、NKT、CD4+T和CD8+T细胞的比例、数目、表面活化标志物CD69的表达以及IFN-γ的分泌功能均无明显变化。3.预先清除Kupffer后,L18-MDP/D-Gal N联合注射不能引起小鼠血清ALT明显升高和肝组织明显坏死。4.联合注射后小鼠肝脏中性粒细胞的比例和数目明显升高,但是预先清除体内Kupffer细胞后,联合注射不能引起中性粒细胞的比例和数目的明显改变。5.联合注射后肝脏小鼠血清和肝脏中TNF-α水平明显升高,但是在预先清除体内Kupffer细胞后不能引起血清中TNF-α的明显变化。此外,预先中和体内TNF-α后,联合注射不能引起血清ALT水平明显升高和大片肝组织坏死。结论:L18-MDP/G-Gal N可诱导基于NOD2受体的小鼠爆发性肝损伤,并且该损伤是由Kupffer细胞介导的。Kupffer细胞不仅促进中性粒细胞在肝脏中的聚集,而且分泌TNF-α来参与肝损伤。