【摘 要】
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酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是目前研究最为透彻的模式真核生物,近几十年来极大地推动了分子生物学、代谢工程、基因组学和合成生物学等多个领域的发展。作为一种理想的微生物细胞工厂,酿酒酵母也被广泛应用于多种高附加值化合物的规模化生产。本论文主要以酿酒酵母为研究对象,探究发展了新型的代谢工程调控工具,并对酿酒酵母葡萄糖去阻遏效应调控靶点进行全基因组筛选。首先,通过优化CRI
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酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是目前研究最为透彻的模式真核生物,近几十年来极大地推动了分子生物学、代谢工程、基因组学和合成生物学等多个领域的发展。作为一种理想的微生物细胞工厂,酿酒酵母也被广泛应用于多种高附加值化合物的规模化生产。本论文主要以酿酒酵母为研究对象,探究发展了新型的代谢工程调控工具,并对酿酒酵母葡萄糖去阻遏效应调控靶点进行全基因组筛选。首先,通过优化CRISPR/Cas9系统,首次在酿酒酵母中利用单一的Cas9-VPR核酸酶实现了基因组多位点同时激活、抑制和编辑（CRISPR-ARE系统）。CRISPR-ARE系统介导的基因敲除效率接近100%,基因转录增强可达到3.8倍左右,基因抑制效率可达到60%以上。将CRISPR-ARE系统应用于代谢工程提升α-檀香烯产量时,同时完成了菌株中HMG1基因的激活、ERG9基因的抑制和UPC2基因的编辑。相比较于出发菌株,单步基因操作即实现了目标产物α-檀香烯产量2.66倍的提升。随后,通过敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧途径构建了丙酮酸脱羧酶敲除菌（Pdc菌株）,并在此基础上引入了细胞质定位的丙酮酸脱氢酶（丙酮酸脱氢酶菌株,PDH菌株）。本研究以这两个模型菌株出发进行了全基因组筛选来鉴定葡萄糖去阻遏效应相关的基因靶点。利用基于多功能CRISPR体系的可追踪全基因组进化技术MAGIC对酿酒酵母在全基因组水平进行了多模式代谢调控（基因激活、抑制和敲除）和筛选。第一轮全基因组规模筛选获得了 70个可以解除葡萄糖阻遏从而恢复Pdc菌株在葡萄糖培养基上生长的基因靶点;而后通过多轮的全基因组建库和高通量筛选的迭代进化,获得了大量的葡萄糖去阻遏效应相关的基因靶点并分别选择了 33个和34个靶点进行逆向代谢工程验证。经过三轮迭代进化,创建的工程菌株（Pdc-R3和PDH-R3）中的葡萄糖阻遏效应逐渐减弱,对葡萄糖的利用能力逐步提高,且具备较强的中间产物丙酮酸积累能力（超过3g/L）、目标产物R-BDO合成能力（超过5g/L）以及混合碳源的共利用能力,具有发展成为利用廉价混合碳源生产高附加值化合物的平台细胞工厂的潜力。最后,考虑到Pdc及其衍生菌株线粒体内增加的碳代谢流,将整个代谢途径共定位至线粒体的区室化工程具有潜在的代谢工程应用价值。多基因代谢途径共定位往往需要借助多个不同信号肽,因此本研究表征和构建了一系列的酿酒酵母线粒体定位信号肽,并探究其在实验室菌株和Pdc平台菌株中的代谢工程应用。通过生长补偿、荧光共聚焦等方式系统地表征了 18个并从中筛选出7个具备良好线粒体定位能力的线粒体定位信号肽。在代谢工程验证中,通过筛选获得的信号肽将完整的甲羟戊酸途径定位至线粒体后,α-檀香烯产量提升至对照菌株的4倍。将线粒体α-檀香烯途径应用于工程菌株PDH-R3中时,其α-檀香烯产量相较于野生型提升了约50%。本论文开发了一种酿酒酵母的代谢调控工具,可以便捷实现基因组多位点多模式协同调控;同时借助新型的CRISPR/Cas工具,对酿酒酵母全基因组进行多模式代谢调控（基因激活、抑制和敲除）,筛选葡萄糖去阻遏效应相关靶点并构建能够积累丙酮酸和乙酰辅酶A的平台菌株。本研究为全面解析葡萄糖阻遏效应的分子机制和构建高效酿酒酵母细胞工厂奠定了基础。
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