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本研究从本实验室近年来分离保存的多株拮抗菌株中筛选出芽孢杆菌(Bacillussp.)NB12、伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)SD7、链霉菌(Streptomyces katrae)NB20等3株菌,它们对水稻纹枯病菌有强烈拮抗作用。这3个拮抗菌株具有广谱抑菌特性,不仅对水稻纹枯病菌、香蕉炭疽病菌、稻瘟病菌、小麦赤霉病菌、香蕉枯萎病菌、荔枝霜疫霉、甘蔗黑腐病菌、番茄叶霉病菌等植物病原真菌有强烈的抑菌作用,而且表现出对水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的良好抑菌效果。
3个拮抗菌株产生的无菌发酵滤液对水稻纹枯病菌的菌丝生长和菌核萌发均有强烈的抑菌作用,对菌丝生长的抑制率分别为:84.57％、88.79%和88.52%,对菌核萌发的抑制率依次为:76%、90%和38%。而且,NB12、SD7的无菌发酵滤液能够延缓菌核形成的时间、影响菌核的分布、减少产生菌核的数量。
菌株NB12、SD7和NB20均能明显地产生蛋白酶,NB12产生蛋白酶和纤维素酶能力最强,但不产生几丁质酶;NB20可产生几丁质酶,但产蛋白酶能力最弱;SD7能产生以上3种酶,但产生的几丁质酶活性极弱。
为了探究以上3个拮抗菌株的生防潜力,研究了它们在水稻植株上的定殖能力和在离体叶片、苗期和分蘖期对水稻纹枯病的防治效果,本研究用利福平(Rif)对NB12和SD7两菌株进行抗药性标记,筛选到抗300μg/mL Rif的抗药性菌株。定殖实验结果表明,两菌株在水稻叶片上均能以较高密度定殖,第20 d仍能检测到106CFU/mL的标记菌株,且10 d后在新生叶片中也可检测到标记菌株。在离体实验中,NB12、SD7和NB20菌液对纹枯病的防效分别达到91.3%、90.0%和54.4%,前两个菌的防效显著高于井冈霉素的防效(77.5%)。3个拮抗菌株对苗期水稻纹枯病也有较好的防治效果,其菌液防效依次为59.9%、53.7%和38.5%,其无菌滤液也有一定防效。但是,3个拮抗菌株对分蘖期水稻纹枯病防治效果不理想,表现较好的NB12菌液和SD7菌液防效也只有17.6%和24.0%,低于井冈霉素的防效(32.9%)。实验中发现,3个拮抗菌株混合处理并没有提高防治效果,反而降低了防效。NB12和SD7两菌株在离体和苗期条件表现了良好的生防能力,但它们对分蘖期水稻纹枯病的生防效果还需要进一步研究。
通过研究NB12和SD7两个菌株所产生的拮抗粗代谢物对温度、pH、紫外线的稳定性以及对蛋白酶的敏感性,发现菌株NB12和SD7所产生的拮抗物质具有较强的耐热性,20～80℃均相对稳定,在121℃,NB12的粗提液仍然表现活性,而SD7的粗提液完完全失活。两菌株产生的拮抗物质具有广泛的耐酸碱性,但在碱性条件更加稳定。两菌株的拮抗粗提液经0～10 h紫外线照射,拮抗活性相对稳定。他们的拮抗粗提液对胰蛋白酶不敏感,只有NB12的粗提液对蛋白酶K部分敏感。
NB12和SD7的拮抗物质既可以通过硫酸铵沉淀得到浓缩,也可以通过有机溶剂萃取获得。经凝胶色谱分离和SDS-PAGE电泳发现,NB12产生一种19 kDa和一种61 kDa的拮抗蛋白。而对组分8～26进行离子交换色谱分离,检测到4个280 nm的活性吸收峰,证明其确实产生了蛋白类拮抗物质。离子交换未出现吸收峰的洗脱液经甲醇萃取和硅胶柱层析,得到一个有微弱拮抗活性的组分,经GC-MS分析,该物质为C16H18的芳香烃类同分异构体。