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初次接触抗原后,抗原特异性的初始T细胞（Naive T cells,TN）增殖分化为效应性T细胞和记忆性T细胞,分别介导T细胞的应答效应和免疫记忆。效应性T细胞获得效应功能的同时,失去自我更新能力,而记忆性T细胞能够长期存活,对抗原再次刺激产生迅速和强烈的应答。T记忆性干细胞(T memory stem cells,TSCM)是近年发现的一个处于分化早期阶段的CD8+T细胞亚群,同时具有干细胞和记忆性T细胞的特征。TSCM在体内外表现出较强的增殖能力和自我更新能力,并且能够分化为中枢记忆性T细胞（Central memory T cells,TCM）,效应记忆性T细胞（Effector memory T cells,TEM）和终末分化效应性T细胞（Effector T cells,TEF）。TSCM在宿主体内具有良好的植入性,并且持续发挥T细胞应答效应,显示出比TCM、TEM和TEF更持久和高效的抗肿瘤效果,是肿瘤免疫治疗的理想种子细胞,因此,在体外制备足够量的抗原特异性TSCM是其应用的前提条件。同种抗原是引起同种异体移植排斥反应的抗原,T细胞对同种抗原和一般抗原的应答均具有p MHC特异性,而且T细胞对同种抗原应答的强度更大。为了方便制备TSCM细胞以及体内外研究,本论文以产生同种抗原特异性T细胞的体外共培养技术为基础,采用抑制T细胞分化的策略,建立同种抗原特异性TSCM细胞的体外制备方法,并且通过体内外实验证实制备的TSCM细胞具有干细胞和记忆性T细胞的行为特征。本论文分为以下三个部分。一、建立同种抗原特异性TSCM细胞的体外制备方法我们利用EB病毒转化的人淋巴母细胞样细胞系（lymphoblastoid cell line,LCL）作为刺激细胞,选用的LCL是已知HLA型别的E007细胞系,以制备E007特异性TSCM细胞为目标。我们建立的方法是:（1）通过E007与同种异体PBLs共培养,使E007特异性T细胞发生增殖,产生E007特异性TSCM细胞;同时采用TWS119抑制TSCM细胞分化,富集E007特异性TSCM细胞;（2）利用流式细胞分选术分选增殖的细胞,以保证制备的TSCM细胞具有E007特异性;（3）分选的T细胞经过细胞因子IL-7和IL-15扩增,使E007特异性TSCM细胞达到足够的数量。我们通过表型CD3+CD8+CD45RA+CD62L+CD95+CCR7+CD28+来检测TSCM细胞。结果显示,同种PBLs与E007共培养后,经过1周时间的TW119抑制TSCM细胞分化,使TSCM细胞的数量富集了约100倍。通过增殖细胞分选,分选出E007特异性淋巴细胞。分选的细胞经过1周时间的IL-7和IL-15扩增,使抗原特异性TSCM细胞数目约增加150倍。经过2周时间,我们建立的同种抗原特异性TSCM细胞制备方法能够从1x107个PBLs制备出约2×107个E007特异性TSCM细胞,可以满足后续体内外相关实验研究对TSCM细胞数量的要求。二、制备的TSCM细胞在体外实验中显示干细胞和记忆性T细胞特征。干细胞特征表现为自我更新和分化的潜能,自我更新是指在增殖的子代细胞中仍保持干细胞的特征。利用增殖细胞的表型分析和TREC水平检测能够反映TSCM的自我更新能力,TREC是TCR基因重排环出片段（T cell receptor rearrangement excision circles,TRECs）,TN的TRECs含量最高,随着克隆增殖其含量逐渐减低,T细胞中TRECs的含量反映其增殖次数。记忆性T细胞特征表现为:在相同的抗原再次刺激时,TSCM细胞迅速增殖分化为效应性T细胞,介导细胞因子产生和细胞毒效应,其中二个重要特征是增殖分化能力和抗原特异性。为了检测制备的TSCM细胞的同种抗原特异性,我们选用与E007的HLA I类分子型别完全不同的另一个LCL细胞系E001作为对照,检测制备的TSCM细胞再次接触抗原时的增殖分化情况。结果显示:制备的TSCM细胞在促分化细胞因子IL-2作用下发生增殖,增殖的每一代细胞中均含有一定比例的TSCM细胞;TSCM的TREC水平介于TN和TCM之间,显示出其自我更新能力。E007能够刺激制备的TSCM细胞迅速发生增殖分化,分化的效应细胞能够产生细胞因子,并发挥细胞毒作用;而作为对照的E001没有这种促进TSCM细胞迅速发生增殖分化的能力,说明制备的TSCM细胞是E007特异性的。通过细胞内细胞因子检测,发现对E007应答的效应细胞主要是TEM和TEF亚群。三、制备的TSCM细胞在小鼠体内具有良好植入性和高效清除靶细胞的能力。植入性是指TSCM细胞在过继宿主体内能够长期存活并发挥功能,通过自我更新和不断分化为效应性T细胞,持续产生T细胞应答效应,有效清除抗原特异性靶细胞。我们将LCL细胞系E007和E001分别注入NOD-SCID小鼠体内,建立荷载LCL的小鼠模型,并将制备的E007特异性TSCM细胞过继小鼠体内,同时设置过继E007特异性TEM和TEF作为对照。定期采集小鼠外周血,检测过继的人T细胞存活情况;过继人T细胞35天后,检测小鼠骨髓和脾中过继的人T细胞存活和亚群分化,并通过检测LCL中EB病毒抗原潜伏膜蛋白1（LMP1）,观察过继的T细胞清除靶细胞的能力。结果显示:LCL细胞注入NOD-SCID小鼠后,主要分布在骨髓和脾脏。过继TSCM细胞组,35天后仍然能够在外周血、骨髓和脾脏检测到人T细胞,TSCM细胞数量在外周血中保持相对稳定,而过继的TEM和TEF细胞组的人T细胞在14天时即消失。在荷载E007的小鼠体内,过继的TSCM细胞分化较多的TEM和TEF,且在骨髓和脾脏中LCL的残留量接近未注入LCL的对照组;而过继E007特异性TEM和TEF小鼠的LCL残留量高于对照组。在荷载E001的小鼠体内,分化的TEM和TEF数量较少,体内LCL残留量相当于仅注入LCL组。以上结果说明TSCM细胞在小鼠体内能够长期存活,并且在相同的同种抗原再次刺激时,TSCM细胞能够分化为效应性T细胞,发挥T细胞应答效应,从而清除同种抗原特异性靶细胞。本研究的创新点和意义本研究建立同种抗原特异性TSCM细胞的体外制备方法,并在体内外实验中证实了制备的TSCM具有干细胞、记忆性T细胞特征和同种抗原特异性。不仅为制备其他抗原特异性TSCM提供可以借鉴的方法,而且为TSCM细胞过继免疫治疗的应用和T细胞分化的研究提供实验和理论基础。由于过继的TSCM在宿主中植入性强并长期发挥效应,制备抗原特异性TSCM细胞在T细胞抗肿瘤、抗慢性病毒感染的过继免疫治疗中具有潜在应用价值。