论文部分内容阅读
目的:谷氨酸(glutamate，Glu)为兴奋性神经递质。谷氨酸转运体-1（glutamatetransporter-1，GLT-1）、谷氨酸-天冬氨酸转运体(glutamate-aspartate transporter，GLAST)和谷氨酸-胱氨酸转运体（cystine/glutamate transporter，xCT）在维持脑内Glu的水平、保护神经系统免受谷氨酸兴奋性神经毒性的影响方面起着重要的作用。本研究采用生物信息学和高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术建立小鼠脑组织中GLT-1、GLAST和xCT蛋白含量的测定方法，并将其应用于雄黄染毒小鼠神经系统毒性研究中，以期为神经毒理学研究中靶标蛋白的精确定量分析提供一个快速、准确、方便的分析方法。 研究方法:1.从NCBI Protein数据库中分别检索小鼠GLT-1、GLAST、xCT三种蛋白的氨基酸序列后，导入Skyline系统中进行模拟水解。利用在线BLAST数据库对每个模拟水解多肽进行特异性分析，挑选出备选特征多肽，并进行化学合成。同时，检索空白基质，设计合成内标多肽和侧翼多肽。 2.采用LC-MS/MS对合成的备选特征多肽进行分析，根据色谱分离特性、质谱响应行为筛选出定量多肽和佐证多肽，同时筛选出空白基质;并设计、合成内标多肽和侧翼定量多肽，进行方法学考查，建立LC-MS/MS测定小鼠脑中GLT-1、GLAST、xCT蛋白含量的方法。并采用星点设计法优化小鼠脑组织前处理条件。 3.应用:SPF级雄性ICR小鼠20只，体重20±2 g，按照体重随机分为4组，每组5只。第1组为空白对照组，灌胃给予0.5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)水溶液;第2～4组分别为低、中、高剂量雄黄染毒组，分别灌胃给予雄黄0.15 g/kg、0.45 g/kg、1.35 g/kg，每日灌胃1次，连续8周.每隔3d称量体重1次，调节灌胃容量。灌胃结束后取大脑，使用所建方法测定小鼠脑中GLT-1、GLAST、xCT蛋白的含量。 结果:1.GLT-1蛋白筛选出2条特征多肽，其中VTLAANGK作为定量多肽，TQSIYDDK作为佐证多肽，VTLAANNGK作为内标多肽。HPLC-MS/MS结果表明，GLT-1蛋白在5～200 ng/mL范围内线性关系良好，R2＞0.99;定量下限为0.16 ng/mL;准确度RSD在1.60％-10.20％之间;日内精密度RSD在3.40％-6.80％，日间精密度RSD在2.30％-5.20％之间;基质效应介于64.10％-79.20％之间，RSD＜7.10％;提取回收率介于74.66％-82.80％之间，RSD＜6.67％。经星点设计实验得出最优酶解条件为:胰蛋白酶与组织匀浆液的比例为1∶30、反应温度为50℃、孵育时间为3.5 h。并用侧翼多肽IDECKVTLAANGKSADCS计算酶解效率，酶解效率为89.0％，稳定性较好。选择鸡大脑组织作为空白生物基质。雄黄暴露8周后，对照组、低、中、高剂量雄黄染毒组中GLT-1蛋白的含量分别为60.4±3.32ng/g、47.2±14.44ng/g、37.6±10.45 ng/g、38.2±7.43 ng/g，各雄黄染毒组与对照组相比均具有统计学意义(P＜0.05)。 2.GLAST蛋白筛选出2条特征多肽，其中VQSLTK作为定量多肽，IVQVTAADAFLDLIR作为佐证多肽，合成的VQSLTTK作为内标多肽。HPLC-MS/MS结果表明，GLAST蛋白在3～58 ng/mL范围内线性关系良好，R2＞0.99;定量下限为0.13 ng/mL;准确度RSD在4.40％-11.80％之间;日内精密度RSD在11.40％-15.02％之间，日间精密度RSD在2.71％-9.77％之间;基质效应介于51.00％-65.50％之间，RSD＜11.00％;提取回收率介于67.42％-78.66％之间，RSD＜7.83％。经星点设计实验优化得出酶解条件胰蛋白酶与组织匀浆液的比例为1∶30、反应温度为50℃、孵育时间为3.5 h，并用合成的侧翼多肽LAKKKVQSLTKEDVKS计算酶解效率，酶解效率为83.23％;稳定性较好，选择鸡大脑组织作为空白生物基质。雄黄暴露8周后，对照组、低、中、高剂量雄黄染毒组中GLAST蛋白含量分别为18.68±5.98 ng/g、10.62±1.72 ng/g、6.80±1.12ng/g、2.47±1.05 ng/g，与对照组相比，雄黄染毒中（P＜0.05）、高(P＜0.01)剂量组具有统计学意义。 3.xCT蛋白筛选出4条特征多肽，其中KPVVATISK作为定量多肽，TLQIILEVVPEDSK作为佐证多肽，合成的KPVLATISK作为内标多肽。HPLC-MS/MS结果表明，xCT蛋白在5～250 ng/mL范围内线性关系良好，R2＞0.99;定量下限为0.22 ng/mL;准确度RSD在11.90％-15.50％之间;日内精密度RSD在7.80％-8.50％之间，日间精密度RSD在1.20％-7.10％之间;基质效应介于55.30％-64.00％之间，RSD＜11.60％;提取回收率介于84.40％-114.66％之间，RSD＜5.00％。经星点设计实验优化得出酶解条件胰蛋白酶与组织匀浆液的比例为1∶30、反应温度为50℃、孵育时间为3.5 h，并用合成的侧翼多肽MVRKPVVATISKGGYLQ计算酶解效率，酶解效率为85.97％;稳定性较好，选择鸡大脑组织作为空白生物基质。雄黄暴露8周后，对照组，低、中、高剂量雄黄染毒组中xCT蛋白含量分别为30.36±5.18 ng/g、39.11±5.24 ng/g、57.33±8.04ng/g、24.42±1.67 ng/g。与对照组相比，雄黄染毒中、高剂量组具有统计学意义（P＜0.05）。 结论:采用生物信息学和LC-MS/MS技术建立的小鼠脑组织中GLT-1、GLAST和xCT蛋白含量的测定方法，具有快速、灵敏、准确、可靠的特点，可用于雄黄染毒小鼠脑中GLT-1、GLAST、xCT的含量测定。