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目的:非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC)是最常见的人类肿瘤之一,以生长快速、易转移、易侵袭和易复发为其特点。有证据表明丝氨酸-精氨酸蛋白激酶-1(serine-arginine protein kinase-1,SRPK-1)的蛋白或m RNA水平在NSCLC组织中上调。然而,SRPK-1的功能和SRPK-1靶向治疗在NSCLC的进展和治疗中仍然知之甚少。本课题的研究目的拟通过基因工程抗体技术构建SRPK-1的嵌合抗体(chimeric antibody of SRPK-1,Chan SRPK-1),通过体内体外研究证实NSCLC中SRPK-1的表达增加;评价构建合成的Chan SRPK-1对NSCLC治疗效果,探讨Chan SRPK-1治疗后NSCLC的迁移和侵袭是否受到抑制。期望通过这一研究探索Chan SRPK-1作用机制,为NSCLC提供新的治疗思路。方法:(1)通过使用常规方法筛选SRPK-1的抗体靶向,为了增强SRPK-1抗体的稳定性和半衰期,成功构建靶向SRPK-1的嵌合抗体Chan SRPK-1,在大肠杆菌表达体系中稳定表达分泌Chan SRPK-1。(2)通过使用SDS-PAGE凝胶电泳确定Chan SRPK-1;使用ELISA和western印迹分析确定Chan SRPK-1具有对SRPK-1的高亲和力,检测Chan SRPK-1表达水平及其具有与SRPK-1特异性结合的能力。(3)通过使用RT-q PCR分析和ELISA分析检测非小细胞肺癌衍生血管内皮细胞(NSCLCDVECs)和MRC-5细胞中的SRPK-1表达水平变化。(4)通过使用MTT比色法检测Chan SRPK-1对NSCLCDVECs生长的体外作用比较细胞活力。(5)通过不同浓度SRPK-1及Chan SRPK-1处理NSCLCDVECs和MRC-5细胞,比较细胞活力、测定迁移和侵袭,证实SRPK-1对迁移和侵袭的作用;Chan SRPK-1对非小细胞肺癌肿瘤细胞存活力、迁移和侵袭的抑制作用。(6)通过使用ELISA和western印迹分析确定NSCLC模型小鼠体内Chan SRPK-1对迁移相关促进蛋白的表达变化,以及分析Chan SRPK-1对肿瘤细胞松弛素D和G-肌动蛋白的表达水平以及GSK3-β的磷酸化的影响。(7)通过给荷瘤小鼠静脉注射400mg Chan SRPK-1,同时注射相同体积的PBS给对照组小鼠,每天1次注射,持续治疗14天后,分别观察25天至120天,记录荷瘤小鼠生存情况分析Chan SRPK-1治疗携带NSCLC的小鼠的肿瘤细胞生长、生存时间、根除率、转移率。结果:(1)使用SDS-PAGE凝胶电泳确定制备的Chan SRPK-1的分子量为约67.5k Da。另外,使用ELISA和western印迹分析确定Chan SRPK-1与SRPK-1保持高亲和力并且具有与SRPK-1结合的能力。(2)使用RT-q PCR分析和ELISA分析NSCLCDVECs和MRC-5细胞,结果显示NSCLCDVECs中SRPK-1的表达与MRC-5人肺细胞中的表达相比上调;Chan SRPK-1处理以剂量依赖性方式(200-2000mg/ml)中和了SRPK-1的表达;Chan SRPK-1处理也以时间依赖性方式中和了SRPK-1的表达;结果还显示Chan SRPK-1(400mg/ml)从48h起抑制NSCLCDVECs生长。(3)Chan SRPK-1对非小细胞肺癌迁移和侵袭的体外抑制作用结果显示,与MRC-5细胞相比,Chan SRPK-1处理组(200、400和1000mg/ml,48小时)NSCLCDVECs的存活力显着降低;与未处理组相比,SRPK-1的存在显着促进NSCLCDVECs在200、400和1000mg/ml剂量下处理24小时的迁移和侵袭;相反Chan SRPK-1显着抑制NSCLCDVECs的迁移、侵袭并促进凋亡发生。NSCLCDVECs中TCF、MMP、CT1和FBC的m RNA表达水平显着高于Chan SRPK-1处理的细胞中的m RNA表达水平(P<0.01),Chan SRPK-1和对照组之间迁移促进蛋白的表达存在显着差异(P<0.01)。Chan SRPK-1处理的肿瘤细胞中细胞松弛素D和G-肌动蛋白表达的下调和GSK3-β的磷酸化显着不同。(4)在动物实验发现与对照组相比Chan SRPK-1处理组中的异种小鼠的肿瘤尺寸受到显著抑制;在用Chan SRPK-1治疗之后,长期存活(超过120天)显著增加;与对照小鼠相比,用Chan SRPK-1(每组中n=10)治疗延长携带NSCLC小鼠的存活时间;Chan SRPK-1治疗对荷瘤小鼠起保护作用;与对照组PBS处理的荷瘤小鼠相比,Chan SRPK-1抑制NSCLC肿瘤转移。结论:(1)结果表明通过使用常规方法构建靶向SRPK-1的嵌合抗体Chan SRPK-1,在大肠杆菌表达体系中稳定高水平表达分泌Chan SRPK-1;Chan SRPK-1具有与SRPK-1特异性结合的能力。(2)结果初步证明Chan SRPK-1在体内和体外均明显抑制NSCLC肿瘤生长、迁移和侵袭,能够控制肿瘤转移、延长生存时间、增加根除率。