基于cell-SELEX技术对从胆管癌细胞株QBC-939的核酸适配体筛选

• 作 者: 叶玲
• 机 构: 湖南大学
• 出 处: 湖南大学
• 发表日期: 2013年期
• 关键词: 核酸适配体 Cell-SELEX技术 细胞株QBC-939 筛选机理 早期检测 肝门部胆管癌

肝门部胆管癌(HCCA)是一种胆道系统常见的恶性肿瘤，由于其发生部位特殊，呈浸润性生长及与肝门部血管关系密切等特点，给手术切除造成极大的困难。目前肝门部胆管癌的临床发现和诊断方法主要是建立在影像学方法上，用来检查组织细胞的形貌。这种方法存在灵敏度不高，特异性差等缺陷。因此，发展具有高特异性和高灵敏度的分子识别探针实现对肝门部胆管癌的早期检测和诊断、肿瘤标志物的发现、肿瘤发病机理研究具有非常重要的意义。核酸适配体是近年来发展起来的一种新型分子识别探针，具有识别范围广、稳定性好、分子量小、易于修饰等特点，目前在分析化学、生物医学等许多领域都得到了广泛应用。　　
本文利用cell-SELEX技术，开展了对人胆管癌细胞株QBC-939核酸适配体筛选的工作，并对筛选得到的核酸适配体进行优化，主要内容如下:　　
(1)基于cell-SELEX技术筛选人胆管癌细胞株QBC-939核酸适配体　　
基于cell-SELEX技术，选择人胆管癌细胞株QBC-939为靶细胞，人肝癌细胞株SMMC-7721为对照细胞，优化了筛选条件，通过逐渐增加筛选的压力（如增加文库与靶标的比例、减少孵育时间、增加洗涤强度、增加反筛强度），经过14轮的反复筛选，对收集的文库进行验证，结果表明与人胆管癌细胞株QBC-939特异性结合的文库得到了高度富集，最终选取第13轮富集产物进行克隆测序。　　
(2)核酸适配体优化以及不同核酸适配体对细胞表面结合位点的考察　　
利用Clustal X2软件模拟通过筛选克隆已经得到的核酸适配体序列的二级结构，并根据序列二级结构的相似性进行归纳分类，共得到六大类不同结构的序列。分别选取六大类序列中的某一序列与细胞进行实验分析，结果获得两条解离常数均在纳摩尔级别且与人胆管癌细胞株QBC-939能特异性结合的核酸适配体。根据序列二级结构的差异性和相似性对获得的两条核酸适配体进行了序列优化，优化后获得一条高亲和力、高特异性的只有23nt的核酸适配体。最后，初步考察了温度对核酸适配体的影响和核酸适配体与细胞的结合位点。