论文部分内容阅读
研究表明人类口腔唾液中的唾液酸凝集素(Salivary agglutinin，SAG)有抑制人类免疫缺陷病毒1型(Human immunodeficiency virustype1，HIV-1)侵染易感细胞的生物学活性，该蛋白的这种生物学活性主要存在于富含半胱氨酸的清道夫受体(scavenger receptorcvsteine-rich domain，SRCR)的N端的第一个富含半胱氨酸的清道夫受体结构域(SRCR Domain)和第一个富含半胱氨酸的清道夫受体间隔结构域(SRCR interspersed domain，SID)的前一半。我们将这段蛋白序列称为N-SRCR。
本实验用PCR扩增N-SRCR结构区基因，克隆到杆状病毒表达载体pFastBacI中，构建重组转座载体pFB-SRCR。用构建的重组转租座载体pFB-SRCR转化E.coil.DH10.Bac感受态细胞，筛选重组阳性菌落，提取重组Bacmid-SRCR，获得含N-SRCR结构区基因的重组杆状病毒穿梭载体。在转染试剂(Cellfectin()Invitrogen)帮助下转染sf9(Spodoptera fragiperda ovary cells)细胞，待出现明显感染症状后，收集含有重组杆状病毒颗粒的培养上清，再次感染Sf9细胞，扩增病毒滴度至表达蛋白所需的滴度(107～108pfu/ml)，然后含该病毒滴度的上清液感染sf9细胞进行蛋白表达。
对感染细胞的上清液首先进行Westen blot分析，可见表达的蛋白能够被所用的单抗213-06识别的条带。用镍柱纯化目的蛋白N-SRCR，进行抗原性及生物学活性鉴定，固相酶联免疫(ELISA)试验表明纯化后的蛋白具有完整的自然构象，能够被其单克隆抗体识别，假病毒中和抑制试验表明纯化后的蛋白具有生物学活性能够有效的抑制HIV-1 JR-FL株对靶细胞的感染，ID50约为1.6μg/ml。
本实验所表达的N-SRCR将为进一步鉴定SAG的N-SRCR结构域上与此活性有关的序列和结构以及新型HIV-1入胞抑制剂的设计提供了足够量的N-SRCR来源。