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本研究分为二部分:
一.K88ad ETEC粘附因子faeG基因的克隆及其重组蛋白的免疫学特性分析
K88ad型产肠毒素大肠杆菌(ETEC)是仔猪黄痢的主要致病菌，依赖菌体表面的鞭毛定居在仔猪小肠绒毛表面，并产生大量的肠毒素，从而导致仔猪腹泻脱水而死亡。FaeG是ETEC鞭毛的主要抗原结构蛋白，但在ETEC中FaeG的稳定存在与分子伴侣FaeE有关，在faeE突变的ETEC中，FaeG因缺乏FaeE的结合保护作用而不能稳定存在，在ETEC细胞周质中很快便被蛋白酶DegP降解。
本文用PCR方法从K88ad型产肠毒素大肠杆菌(ETEC)的质粒DNA中扩增出不含信号肽的粘附因子基因(faeG)，研究faeG基因在异源系统中表达的可能性。首先，将该基因片段与大肠杆菌表达载体pET28a连接获得大肠杆菌重组质粒p8801。将重组质粒转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)获得重组菌株BL21(DE3+K88)，该菌株37℃培养后经IPTG诱导，SDS-PAGE检测表明该基因在大肠杆菌中以包涵体形式得到高效表达，重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的30％以上，经过包涵体纯化，尿素变性、复性后，重组FaeG蛋白纯度达到占总蛋白的85％以上。用纯化的重组蛋白免疫怀孕母猪，免疫30天后母猪血清以及猪乳中产生了高滴度的抗K88特异抗体；用K88ad型ETEC接种免疫母猪所产的小猪，观察发现母乳中产生的抗体对仔猪有免疫保护作用。首次证明ETEC鞭毛的主要结构蛋白FaeG可以在大肠杆菌中高效表达，且重组蛋白免疫母猪后可以被动免疫保护小猪。
同时，利用转基因植物研究生产新型K88adETEC的疫苗的可能性，我们构建了含K88ad鞭毛主要结构基因(faeG)的植物双元表达载体，转化并获得了稳定表达FaeG重组蛋白的转基因烟草和土豆，并对转基因烟草中表达的重组蛋白进行了分子检测及免疫学分析。筛选出表达量高(重组FaeG占细胞总可溶蛋白的0.15％)的转基因烟草植株，分别提取转基因烟草粗蛋白进行注射和口服免疫。取注射免疫小鼠血清进行ELISA及Westernblot分析表明，转基因烟草表达的FaeG重组蛋白注射免疫小鼠后诱导小鼠发生免疫反应，产生抗K88adETEC鞭毛蛋白的特异抗体；用免疫小鼠的抗血清中和K88adETEC进行兔肠结扎实验，小肠内积液量明显低于对照组；同时，猪小肠绒毛受体体外结合抑制实验还证实小鼠抗血清能抑制K88adETEC在小肠绒毛上的粘附。经转基因烟草表达的FaeG重组蛋白口服免疫的小鼠血清和粪便中也可检测到特异的抗K88adETEC的抗体，这些结果表明转基因植物表达的FaeG重组蛋白具有良好的免疫原性，能诱导小鼠产生体液免疫反应和粘膜免疫反应。这为利用转基因植物研制仔猪黄痢新型疫苗，提供了一种新方法。
本文研究结果证实不含信号肽的K88adETEC粘附因子faeG基因可以稳定地在大肠杆菌和植物中表达，并具有较强的免疫原性。为研究新型仔猪黄痢基因工程疫苗提供了新的思路，也为研制其它含有多蛋白亚基的鞭毛结构的致病菌新型疫苗提供了一种新的尝试。
二.“O”型口蹄疫病毒保护性抗原表位和人乙型肝炎核心抗原融合及其在烟草中的表达
本文利用基因工程方法将FMDV的VPI 140-160位氨基酸和HBcAg的免疫优势区c/el 80-81位融合，构建植物双元表达载体PSVP并转入农杆菌LBA 4404,经农杆菌介导转入烟草。抽提转基因烟草粗蛋白进行免疫学分析表明，融合基因在转基因烟草中得到转录并表达，重组HBCVP融合蛋白可形成VLP结构，并具有HBcAg和VPI双重免疫原性。含重组蛋白的蛋白粗提液免疫小鼠后可刺激小鼠产生抗FMDV抗体，攻毒实验结果表明免疫后血清中抗体可以保护小鼠免受FMDV的感染，具免疫保护作用。这为研制新型口蹄疫植物疫苗提供了一种新的方法，并为研究将HBcAg作为免疫载体融合其它小分子的抗原表位在植物中表达提供有益的尝试。