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O-GlcNAc是一种广泛存在于蛋白质丝/苏氨酸残基上的一种动态、可逆的蛋白翻译后修饰,它主要分布在细胞浆和细胞核中,参与调解许多细胞途径。近年来的一些研究已经证明O-GlcNAc的异常与神经退行性疾病、糖尿病等疾病相关。O-GlcNAc修饰是由O-连接N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(OGT)和O-连接N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(OGA)协同完成的,所以对OGT进行深入研究意义重大。
OGT是一个分子量比较大的蛋白,所以要在体外表达OGT比较困难。利用分子生物学实验方法,我们成功地将mOGT、ncOGT以及mOGT的截短型基因片段克隆到原核表达载体pET-21a(+)上,获得重组质粒pET21/mOGT、pET21/ncOGT、pET21/mOGT(3TPR)和pET21/mOGT(5TPR),转入BL21(DE3)中进行表达。我们在低温条件下诱导出了少量的mOGT,以及大量的mOGT(3TPR)和mOGT(5TPR)蛋白。依次用镍柱亲和层析和分子筛纯化蛋白,我们得到了纯度高达85％的mOGT(5TPR)蛋白,并通过Wegem blot检验到纯化得到的蛋白具有OGT免疫学特异性。
OGT蛋白含有两个功能结构域,氨基端的三十四肽重复序列(tetratricopeptiderepeat,TPR)和羧基端的催化结构域。TPR结构主要参与OGT的底物识别,不同长度的TPR结构具有不同的识别能力,有研究表明随着TPR长度的减少,其结合大分子底物的能力会减弱,但其对小分子多肽的结合能力会增加。故我们就以人工合成的九肽为底物检测了体外表达的mOGT(5TPR)蛋白的酶活。
我们创新性的发展了一种检测OGT活性的新方法:酶偶联法。这种方法主要是通过检测转糖基反应中UDP的生成量来检测OGT活性的。这种方法的主要原理是:UDP和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)在丙酮酸激酶的作用下转化成丙酮酸,然后通过商品化的丙酮酸检测试剂盒来检测丙酮酸的生成量,在试剂盒的作用下丙酮酸会转化成一种在570 nm处有紫外吸收的红色产物,然后通过没标仪读取数值。通过对mOGT(5TPR)的进行酶学常数研究,我们得到mOGT(5TPR)对L5DP-GlcNAc和九肽的Km值分别是0.17mM和0.16mM,说明OGT对UDP-GlcNAc和九肽有相同的亲和力。并且OGT对UDP-GlcNAc的Km值与文献报道的60μM在同一水平。
总之,我们成功的构建了OGT的原核表达菌株,并表达纯化出高纯度,具有一定活性的截短型OGT蛋白。随后我们发展了一种检测OGT活性的新方法,并对截短型OGT进行酶活测定,得到了与文献报道相一致的结果。