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第一部分小鼠海马神经元原代培养及氧糖剥夺／复氧损伤模型的建立目的利用缺氧培养室(Anaero Pack Pouch CX-31)物理缺氧以及培养基缺糖的方式建立小鼠海马神经元的氧糖剥夺／复氧(oxygen and glucose deprivation/ reoxygperfusion, OGD/R)损伤模型,探索缺氧缺糖损伤及复氧的合适时间,并观察复氧是否对缺氧缺糖损伤的神经元产生进一步损伤。方法取新生C57BL/6乳小鼠的海马原代培养神经元。神经元培养8d后随机分为正常对照组及模型组(OGD/R组)。OGD/R组缺氧缺糖设4h、8h、12h三个时间点,复氧设0h、24h两个时间点。将Neurobasal/B27神经元培养基替换成无糖Earle’s缓冲盐溶液,并置于缺氧培养室中分别缺氧培养4h、8h或12h,然后恢复到正常培养条件中0h或24h,来建立OGD/R组神经元氧糖剥夺／复氧损伤模型。采用MTT比色法测定各组神经元细胞的存活率,并检测各组神经元培养液中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)的含量水平。结果与正常神经元相比,随着氧糖剥夺时间的延长,其他各组神经元细胞存活率显著下降(P<0.001),同时培养基LDH含量显著升高(P<0.001)。OGD4h/R24h组较OGD4h/R0h组神经元细胞存活率显著减低,LDH含量明显升高,且差异均有统计学意义(P<0.01)。OGD4h/R24h组神经元细胞存活率约59.96%,为本实验较合适的OGD/R模型。结论利用缺氧培养室物理缺氧以及无糖Earle’s缓冲盐溶液可成功建立小鼠海马神经元氧糖剥夺／复氧损伤模型。同时,复氧可对缺氧缺糖4h后的神经元产生进一步损伤。建议本实验采用氧糖剥夺4h/复氧24h(OGD4h/R24h)模型。第二部分 内皮祖细胞对氧糖剥夺/复氧损伤神经元的保护作用目的研究内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)共培养对氧糖剥夺/复氧(oxygen and glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)损伤神经兀是否有保护作用。方法分离培养新生C57BL/6乳小鼠的海马神经元,利用缺氧培养室建立神经元OGD/R模型。应用密度梯度离心法分离培养C57BL/6小鼠的骨髓源性EPCs。采用Transwell小室建立EPCs与OGD/R损伤神经元的共培养系统。随机地将神经元分为对照组、OGD/R组、EPCs共培养组及EPCs共培养并加入一氧化氮合成酶抑制剂(Noo-nitro-Larginine methyl ester,LNAME)组。各组神经兀调亡率用TUNEL巧光法检测。用western blot法检测各组神经元caspase 3及内皮型一氧化氮合成酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)的活性。结果OGD/R组神经元的细胞调亡率和caspase 3活性较对照组显著増加。与OGD/R组相比,EPCs共培养组神经元调亡情况显著降低(P<0.05)且eNOS磷酸化水平明显增高(P<0.05)。而与EPCs共培养组相比,EPCs+L-NAME组神经元调亡情况明显增加(P<0.05),且eNOS磷酸化水平也明显下降(P<0.05)。结论与EPCs共培养可以通过提高神经元eNOS活性来保护OGD/R损伤的神经元。L-NAME可以减轻EPCs共培养对OGD/R损伤的神经元保护作用。