论文部分内容阅读
慢性淋巴性白血病(CLL)是流行范围最广，最难治愈的一种B细胞恶性肿瘤。传统的针对CLL的药物有烷基化试剂、嘌呤类似物拮抗剂、抗CD20单克隆抗体等，但这些药物的临床治疗效果有限，并且会产生严重的副作用。近年来，随着对调控B细胞生长增殖的分子信号通路的研究深入，针对CLL的治疗出现了新的分子靶向性治疗。其中，PI3K家族中的PI3Kδ成为治疗CLL的有效靶点之一。2014年7月，第一个选择性的PI3Kδ抑制剂idelalisib被FDA批准上市，用于治疗CLL，这无疑为PI3Kδ作为治疗CLL等B细胞恶性肿瘤的有效分子靶标提供了强有力的支持。随着idelalisib的上市，选择性PI3Kδ抑制剂的研发成为研究的热点，许多idelalisib的结构类似物作为后续的选择性PI3Kδ抑制剂进入临床研究。作为首创性的选择性PI3Kδ抑制剂，idelalisib在CLL等B细胞恶性肿瘤的治疗中显示出了显著的治疗效果，同时也引起了一些严重的毒副作用，包括致命性或者严重的腹泻、结肠炎、肝毒性、肺炎或者肠穿孔等;此外，idelalisib与CYP3A酶的诱导剂或底物会产生药物相互作用。鉴于idelalisib对CLL等B细胞恶性肿瘤的显著治疗效果，但同时也具有临床毒副作用以及药物相互作用等急需改善的缺点，本论文选择idelalisib作为先导化合物，进一步开发新型的选择性PI3Kδ抑制剂，探索结构与靶标选择性和安全性的关系。Idelalisib采用类似“螺旋桨”的构象与PI3Kδ结合，诱导原型酶发生构象改变，形成新的特异性结合口袋;在铰链区，idelalisib与氨基酸残基Val828、Glu826形成两个氢键作用。在充分理解其作用模式的基础上，我们针对idelalisib的铰链区、中间连接链和喹唑啉酮的5位三个位点，通过生物电子等排替换、环合、优势片段杂合等策略，设计合成了五个系列的化合物。其中，化合物3-20d表现出了较强的PI3Kδ活性，IC50值为3.82nM，在SU-DHL-6B淋巴细胞中的IC50值为7.6nM，是idelalisib的15倍;同时3-20d对PI3Kα有154倍的选择性，对PI3Kβ有133倍的选择性，对PI3Kγ有24倍的选择性。值得一提的是，与idelalisib相比，3-20d对人白血病细胞系显示出更广谱的增殖抑制活性，对T淋巴细胞MOLT-4也显示出很好的抑制活性，IC50值为6.7μM;而idelalisib对MOLT-4没有抑制活性，提示我们，3-20d对T细胞介导的白血病可能也具有治疗作用。 不同于喹唑啉酮类PI3Kδ抑制剂，另一类噻吩并[3，2-d]嘧啶类选择性PI3Kδ抑制剂不会诱导PI3Kδ发生构象改变，其选择性源于PI3Kδ的亲和口袋和色氨酸凹槽的共同作用。亲和口袋中的吲哚片段的引入增强了PI3Kδ选择性，但同时也会产生CYP3A4酶抑制活性。由于这类化合物具有很好活性和选择性，我们也对这类分子进行了优化，设计合成了一系列侧链含有不同取代吗啉的衍生物;并且对亲和口袋中的吲哚片段进行了探索，期望可以消除对CYP3A4酶的抑制活性。其中化合物4-9b的酶活性为31.2nM，在SU-DHL-6细胞中的活性为83.8nM，略优于阳性对照PI-3065(33.0nM和342.5nM)，但是与现有的PI3Kδ抑制剂相比，4-9b的活性明显比较弱。 PI3Kγ作为PI3K家族中唯一一个IB类成员，近年来得到越来越多的关注。研究表明，PI3Kγ是肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)中肿瘤免疫激活和免疫抑制的重要“开关”。抑制TAMs中PI3Kγ的活性，可以阻断肿瘤微环境中的免疫抑制状态，促进免疫激活，促进细胞毒T细胞介导的肿瘤消退，重塑肿瘤免疫微环境，从而抑制肿瘤生长;还可以克服免疫检查点阻断治疗产生的耐药性，为临床联合用药提供理论基础。因此，PI3Kγ有望成为肿瘤免疫治疗中的有效靶点。到目前为止，针对选择性PI3Kγ抑制剂的研究相对较少，进入临床研究的只有3个小分子:duvelisib、IPI-549和tenalisib，均是喹唑啉酮类衍生物，其中只有IPI-549是真正的选择性PI3Kγ抑制剂，目前作为肿瘤免疫的候选物，针对晚期实体瘤，处于I期临床研究中。因此，开发新型的选择性PI3Kγ抑制剂迫在眉睫。Vertex公司2015年报道的2-氨基噻唑类化合物1-45和1-46是不同于喹唑啉酮类，具有高选择性和高活性的PI3Kγ抑制剂。在充分分析1-45与PI3Kγ酶的结合模式后，我们以1-45为先导化合物，通过开环、炔基插入、并环、骨架跃迁等策略，设计合成了三类PI3Kγ抑制剂衍生物:2-氨基噻唑、吡唑双环和吡唑三环。在4，5，6，7-四氢吡唑并[1，5-a]吡嗪和吡唑并[1，5-a]吡啶双环类化合物中，PI3Kγ酶活性最好的化合物为5-69b，IC50值为49.3nM，是阳性对照1-45的4.5倍。我们进一步将吡唑并[1，5-a]吡啶的3位碳原子与2位氨基环合，得到了一系列吡唑三环类化合物，其中PI3Kγ酶活性最好的化合物5-76h的IC50值为53.5nM，是阳性对照1-45的4.2倍。我们选取了PI3Kγ酶活性较好的吡唑并[1，5-a]吡啶类化合物5-67j(IC50:94.6nM)和吡唑三环类化合物5-76a(IC50:59.6nM)进行了亚型选择性评价，遗憾的是，两者的PI3Kγ的选择性不佳。我们下一步的目标是在继续提高PI3Kγ活性的同时，致力于增加化合物对PI3Kγ的选择性。 虽然PI3Kγ在大多数实体瘤癌细胞中并不常见，但是在TAMs等肿瘤基质细胞中高表达，并且是TAMs中肿瘤免疫激活与抑制的“开关”。研究表明基因敲除和药理学抑制PI3Kγ可以重编TAMs从免疫抑制表型转化为免疫激活表型，从而抑制多种实体瘤的生长和转移。众所周知，实体瘤是由癌细胞和肿瘤相关基质细胞组成的高度复杂的病理组织。针对实体瘤的分子靶向性药物与PI3Kγ抑制剂联用，通过直接作用于癌细胞和肿瘤免疫微环境，可能对实体瘤提供一种新的治疗策略。近年来研究表明PI3K信号通路的上游信号FGF/FGFR，可以通过下游两个主要信号通路RAS/MAPK和PI3K/AKT控制细胞的增殖、生存、迁移、分化、胚胎发育等。除了调控正常的生理过程，FGFR还可作为致癌基因，参与多种实体瘤的发生发展。已有文献报道在膀胱癌、肺癌、乳腺癌等实体瘤的临床样本中显示FGFR信号异常;异常的FGFR激活还与肿瘤转移扩散和不良预后密切相关。因此，FGFR已成为治疗伴有FGFR表达异常的实体瘤的有效靶点。结合临床在研的选择性FGFR抑制剂AZD-4547和FGFR/VEGFR双靶抑制剂lucitanib作用模式的相似性，我们在lucitanib的基础上，通过开环、骨架跃迁策略，并引入AZD-4547的优势片段，设计合成了一系列新颖的2-苯甲酰胺4-芳香环氧代吡啶类衍生物。与lucitanib相比，新化合物对FGFR活性显著增强。其中化合物7-21a对FGFR1、FGFR2和VEGFR2的IC50值分别为1.0nM、4.5nM和2.9nM，并且对FGFR1和FGFR2异常的KG1细胞和SNU16细胞也具有较强的增殖抑制活性，IC50小于0.5nM;对BAF3/VEGFR-2细胞的IC50值小于1.5nM。对于FGFR2扩增的SNU-16裸小鼠移植瘤模型，7-21a在10mg/kg和50mg/kg的剂量下，肿瘤抑制率分别为25.0％和81.0％，并且小鼠没有明显的体重下降。考虑到FGFs和VEGFs在肿瘤血管生成中的协同作用，具有同等活性的FGFR/VEGFR双靶抑制剂7-21a可能具有更好的临床效果。目前，7-21a的盐酸盐形式作为单一用药或与PI3Kγ抑制剂联用正在进一步评价中。