论文部分内容阅读
维生素K2是一种具有重要生理活性的K族维生素，对促凝血、抗骨质疏松以及治疗帕金森症等都具有较好的功效。微生物发酵法较化学法合成维生素K2，具有发酵原料易得、条件温和、环境压力低，同时因为本身来源于生物，制备的维生素K2具有高生物活性和高生物相容性，易于人体吸收与利用等优势。论文采用离子束诱变技术结合流式细胞仪筛选，加入表面活性剂强化发酵过程，促进维生素K2发酵制备效率，进行了如下研究: 一、将VK2代谢合成中间物的结构类似物HNA用于突变株初筛，摸索了HNA的较佳初筛浓度;并将传统化学诱变剂NTG与新型物理诱变源低能离子束应用到E.coli FM1-6产VK2菌株的复合诱变选育中，优化了诱变处理条件，得出较佳诱变条件。结果表明:HNA的较佳初筛浓度是450 mg/L; NTG诱变的较优条件是NTG浓度200 mg/L，处理时间20 min; N+注入的较优条件是注入能量15 keV，剂量60×2.6×1013 N+/cm2;经过8轮诱变，最终筛选得到各种不同产量突变菌株，其中突变株FM5-632，其VK2的产量达到123.2μg/L左右，较出发菌株FM1-6提高了3倍多;连续传代8次，VK2的产量稳定;通过气相色谱-高分辨飞行时间质谱联用仪及高效液相色谱分析，胞内发酵产品主要成分是MK-4。研究结果表明化学诱变剂NTG和物理诱变源离子束复合诱变对E coli的诱变效果显著。 二、作为调节原核生物呼吸链上电子传递反应的重要物质，维生素K2作为电子载体或受体影响着细胞膜电位的高低，而作为能够反映细胞膜电位高低的荧光染料Rh123，起到了较好的桥联菌体内维生素K2产量和流式细胞仪荧光信号的作用。采用荧光载体Rh123建立了流式细胞术快速筛选维生素K2优势菌的方法。采用的较优工艺条件是:突变株发酵液，冰浴10 min后8000 rpm离心，沉淀重悬于加有10％蔗糖的TSE缓冲液中孵育10 min，离心。菌体经1 mM MgCl2悬浮，5μL Rh123母液染料，室温下暗处孵化10 min后离心，去除多余的荧光染料，得到的菌体经去离子水清洗后悬液均匀，流式细胞仪FL1通道检测。工艺经过优化后，优势菌与干扰物质得到了有效区分。流式细胞仪快速分选的产量与荧光强度的相关性能达到98.38％。 三、通过单因素实验对E.coli FM5-632生产维生素K2的发酵条件进行了研究，主要包括碳源、氮源、无机离子种类，发酵温度、起始pH值、摇床转速等。Plackett-Burman试验从众多影响目标产物发酵生成的因素中优选出显著影响因素，最后利用响应面法对发酵条件进行了优化，建立了相应的模型。经过优化之后，得到了维生素K2的较优发酵培养条件:甘油15.31 g/L、酵母提取物2.89 g/L、蛋白胨10 g/L、香柏油0.04 g/L、NaCl1.0 g/L、K2HPO45.0 g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L，pH7.0，接种量为10％，摇床转速为180 rpm，33℃培养120 h。优化后FM5-632维生素K2的产量达到了173.2μ.g/L，是优化前的1.4倍。 四、渗漏发酵可以显著提高胞外MK-4的含量，对渗漏剂的种类及其浓度进行了优化，并分析比较了不同处理方式下发酵液的表面张力、菌体形态、动力学参数、细胞膜通透性。结果表明:表面活性剂具有能将胞内MK-4渗漏至胞外从而减小产物抑制增加目标代谢物总产量的能力。然而，不同渗漏剂以及同一渗漏剂不同浓度的渗漏能力不同。当添加1.0 g/L非离子型表面活性剂POE时，胞外MK-4产量达到最大，567.26±21.61μg/L，总MK-4产量为684.08μg/L，较未渗漏前有了大幅度提高。渗漏培养基表面张力值降低，发酵液较澄清，菌体周围富集了大量表面活性剂胶团。流式细胞仪检测结果表明:渗漏培养后的菌体细胞膜通透性提高，有利于发酵过程中维生素K2产量的提高。