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本研究的主要目的是利用热休克蛋白HSP65与α毒素免疫原性部分融合表达来增强疫苗的免疫效果,另外在本实验室前期通过全人源噬菌体抗体库筛选获得的针对α毒素的全人源单链抗体的基础上,进一步深入地研究该单链抗体的生物学活性,并利用分子克隆技术构建针对α毒素的全人源双价单链抗体以提高单链抗体的结合活性,为防治A型产气荚膜梭菌α毒素引起的各类疾病奠定基础。本研究利用基因工程技术,以CPA全基因为模板,PCR扩增rCPA基因(敲除了CPA编码溶血性和致死性的酶活基因片段,保留具有免疫原性的部分),插入表达载体pET-28a(+)-HSP65,双酶切及测序鉴定表明成功构建重组表达载体pET-28a-rCPA-HSP65,转化E.coli BL21(DE3),以IPTG于34℃诱导表达5 h,表达产物进行12%SDS-PAGE分析,重组蛋白的相对分子量大小约为90kDa,而且大部分是以可溶形式产生的,表达量占菌体总蛋白的30.17%。接下来从培养基类型、诱导温度和诱导时间对其表达条件进行优化并进行高密度发酵表达,产物经一步DEAE弱阴离子交换层析柱上纯化和复性后,再经金属螯合层析纯化,纯度达到95%左右。将纯品rCPA-HSP65按常规免疫程序免疫小鼠,以rCPA和HSP65蛋白做对照,然后利用间接ELISA方法检测各组小鼠外周血抗体滴度大小并进行了比较,融合蛋白rCPA-HSP65免疫后的小鼠外周血中和抗体水平持续增长,并在三免后平均中和抗体效价达212左右,且rCPA-HSP65组免疫的血清抗体效价明显高于rCPA组。小鼠体内毒素中和试验显示免疫血清可在体内具有明显中和α毒素的致死性作用。攻毒保护试验显示,以2×LD50的α毒素静脉攻击rCPA-HSP65免疫组的小鼠,可获得80%以上的保护。将全人源抗CPA-scFv的菌株进行高密度发酵并经IPTG以28℃诱导表达6 h左右,发酵后的菌液经过离心收集上清,先经60%饱和硫酸铵盐析,用PB悬起后在PBS中透析过夜,经过金属螯合层析的粗纯以及rProtein A亲和层析精纯,获得纯品scFv,相对分子量约为31 kDa,符合预期大小,纯度为97%左右。WB法显示在43 kDa处有一明显的特异性免疫条带,表明纯化的scFv与CPA具有较好的免疫结合活性;利用表面等离子共振技术(SPR)进行结合动力学的精确分析,显示scFv与CPA的平衡结合常数(KA)为2.02×1010(1/M),平衡解离常数(KD)为4.94×10-11(M);利用scFv在体外可以中和CPA水解卵磷脂活性和溶血活性的特点,将不同量的scFv与α毒素37℃下预先孵育2 h,然后分别于卵黄稀释液和2%鼠红细胞悬液以及羊血液琼脂平板在37℃作用2 h,通过检测反应后的卵黄稀释液的OD620和红细胞悬液离心上清的OD450以及观察血琼脂板上的溶血情况表明,scFv具有良好的抑制CPA卵磷脂酶C活性的作用并能有效中和CPA的溶血活性,且两者均具有浓度依赖性;在体内中和试验中,2×LD50剂量的CPA与抗体孵育后静脉注射小鼠,与对照组相比,毒素与抗体按1:10和1:15时可以达到全部保护,而低于1:8时则会出现小鼠死亡,初步得出中和剂量为2×LD50毒素所需要的抗体最少剂量约为18.69 mg/kg,记为m(scFv)。在攻毒保护试验试验中,以2×m(scFv)的抗体静脉注射小鼠,之后不同时间段以2×LD50攻毒,结果在注射抗体之后1小时攻毒保护率达到80%。在攻毒救治试验中,以2×LD50剂量的毒素CPA提前静脉攻毒小鼠,不同时间段用2×m(scFv)的抗体进行救治,结果发现,在30分钟之内救治率可达到80%以上,而超过1小时甚至2小时之后再救治小鼠几乎全部死亡。结果表明用单链抗体救治CPA中毒时,快速准确诊断和及时治疗是非常重要的。取CPA攻毒后抗体救治存活小鼠的各主要脏器进行病理组织学观察,以攻毒后未救治而死亡的小鼠作对照,结果发现未用抗体救治而死亡小鼠的脏器出现不同程度的严重病变,而用抗体救治存活小鼠病变轻微。然而,与完整单抗分子相比,具有单一结合位点的scFv结合力相对较低。另外,scFv另一特点是分子量较小,在体内易被肾脏清除从而导致它的体内不稳定性。因此,我们利用分子克隆技术构建并表达了针对CPA的特异性双价单链抗体并对其生物活性进行了初步研究,具体步骤如下:以单链抗体scFv全基因为模板,扩增两条scFv基因片段并经不同长度连接肽G4S或(G4S)3连接,亚克隆至原核表达载体pET-28a(+),经双酶切鉴定及基因测序结果表明正确构建了双价单链抗体sc(Fv)-G4S-sc(Fv)和sc(Fv)-(G4S)3-sc(Fv),分别简记为sc(Fv)2-5和sc(Fv)2-15。将重组载体转化原核表达菌株E.coli BL21(DE3),经IPTG于30℃诱导表达5 h并进行12%SDS-PAG分析鉴定,双价单链抗体以包涵体形式表达为主,相对分子质量与预期大小相同。对包涵体进行洗涤和变性溶解,经铜离子金属螯合层析粗纯,目的蛋白洗脱液进行多步透析法复性,再经rProtein-A亲和层析纯化和分子筛S-75最终精纯,获得纯度较高的双价单链抗体。利用间接ELISA法对双价单链抗体与CPA的结合能力进行评价,结果显示sc(Fv)2-15与CPA的结合活性高于scFv和sc(Fv)2-5。在体外毒素中和活性检测中,等摩尔的scFv、sc(Fv)2-5和sc(Fv)2-15与CPA毒素孵育后分别与稀释的卵黄液和鼠红细胞悬液作用,结果显示scFv、sc(Fv)2-5和sc(Fv)2-15均可有效中和CPA水解卵磷脂活性和溶血活性,且sc(Fv)2-15中和效果明显高于scFv和sc(Fv)2-5。在攻毒保护试验中比较等摩尔量的抗体sc(Fv)2-15和scFv对小鼠进行预保护后不同时间静脉攻毒的保护率,证实sc(Fv)2-15对小鼠的攻毒保护效果优于scFv。本研究成功获得了A型产气荚膜梭菌α毒素的重组疫苗蛋白rCPA-HSP65并对其免疫效果进行了评价,深入地研究了针对α毒素全人源单链抗体的生物学活性并成功构建了针对α毒素的全人源双价单链抗体且提高了单链抗体的结合活性,为进一步研究A型产气荚膜梭菌α毒素的防治措施奠定了基础。