密码子优化对毕赤酵母表达单宁酶酶学性质和构象影响研究

• 作 者: 王少曼
• 出 处: 南昌大学
• 发表日期: 2004年期
• 关键词: 单宁酶 毕赤酵母 基因克隆 密码子优化 酶学性质 空间构象

单宁酶（Tannase,EC 3.1.1.20）可以催化水解单宁酸和没食子酸酯类中的酯键和缩酚酸键,水解产物为没食子酸、葡萄糖及多元醇类化合物,因而被广泛应用于食品、制革、饲料、制药等行业中。目前主要通过米曲霉、黑曲霉的深层液态和半固态发酵法生产单宁酶,存在产量低、纯化工艺复杂、生产成本高、经济效益低等缺点。随着现代分子生物学技术的发展,通过基因工程手段,克隆单宁酶基因到目的宿主菌株中,实现单宁酶的高效表达,无疑是解决工业化生产单宁酶难题的有效手段。毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统是近年来最为成功的真核表达系统之一,而外源基因序列自身的稀有密码子是外源基因在毕赤酵母中成功实现表达的一个瓶颈。稀有密码子的存在会严重降低m RNA与核糖体的结合能力,阻碍外源蛋白的翻译,影响外源蛋白的表达量和结构。通过密码子优化可提高外源蛋白的翻译效率,从而提高表达水平。本研究以Aspergillus oryzae NCU 002单宁酶为研究对象,对单宁酶基因密码子优化后转化至毕赤酵母GS115中,研究密码子优化对毕赤酵母分泌表达单宁酶的表达水平、酶学性质和空间构象的影响。主要研究结果如下:（1）以A.oryzae NCU 002基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到米曲霉单宁酶基因序列,对单宁酶基因序列分析后,发现该基因的密码子适应指数CAI值（0.65）偏低。根据毕赤酵母密码子的使用偏爱性,结合GC含量和m RNA二级结构,在不改变单宁酶原有氨基酸序列情况下进行DNA密码子优化,并将经过密码子优化后的单宁酶基因（Tanop）及野生型单宁酶基因（Tanwt）分别构建到表达载体p PICZαC上,形成重组质粒p PICZαC-Tanop和p PICZαC-Tanwt。将两种重组质粒分别转化至毕赤酵母GS115中,通过单宁酶活力定性鉴别平板和PCR鉴定方法分别筛选得到表达水平较高的含有Tanop基因、Tanwt基因的重组毕赤酵母各1株,分别命名为P.pastoris GS115/p PICZαC-Tanop8、P.pastoris GS115/p PICZαC-Tanwt10。甲醇诱导24 h后两株重组菌产单宁酶酶活分别为3.08 U/m L、2.34 U/m L。密码子优化后的重组毕赤酵母菌株P.pastoris GS115/p PICZαC-Tanop8产酶能力是含野生型基因的重组毕赤酵母菌株P.pastoris GS115/p PICZαC-Tanwt10产酶能力的1.32倍。（2）通过研究甲醇浓度、磷酸钾缓冲液p H值、接种量OD₆₀₀、诱导温度、发酵时间对P.pastoris GS115/p PICZαC-Tanop8和P.pastoris GS115/p PICZαC-Tanwt10分泌表达重组单宁酶的影响,得出最佳发酵条件均为:甲醇浓度0.5%、磷酸钾缓冲液p H值3.0、接种量OD₆₀₀ 1.0、诱导温度22℃、发酵时间36 h。在此条件下,菌株P.pastoris GS115/p PICZαC-Tanop8最高产酶量为29.38 U/m L,是发酵条件优化前的9.54倍;菌株P.pastoris GS115/p PICZαC-Tanwt10最高产酶为19.02 U/m L,是发酵条件优化前的8.13倍。密码子优化后菌株P.pastoris GS115/p PICZαC-Tanop8产酶能力是含野生型基因的菌株P.pastoris GS115/p PICZαC-Tanwt10产酶能力的1.54倍,表明密码子优化提高了重组菌株的产酶能力。（3）将菌株P.pastoris GS115/p PICZαC-Tanop8和P.pastoris GS115/p PICZαC-Tanwt10的发酵粗酶液经过卷式膜超滤浓缩、硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱纯化后得到电泳纯的重组单宁酶,通过SDS-PAGE电泳得出Tanop重组单宁酶和Tanwt重组单宁酶的分子量均为59.5 k Da。Tanop重组单宁酶的比酶活为1362.67 U/mg,酶活回收率为8.5%,纯化倍数为10.65;Tanwt重组单宁酶的比酶活为975.23 U/mg,酶活回收率为13.1%,纯化倍数为15.37,表明密码子优化提高了重组单宁酶的比酶活。（4）比较了Tanop重组单宁酶和Tanwt重组单宁酶的酶学性质,得出结果如下:（1）p H值和温度对Tanop重组单宁酶和Tanwt重组单宁酶的影响不大,两者最适反应p H均为5.5,p H稳定范围均为p H 3.5～p H 8.0。两者最适反应温度均为35℃,温度稳定范围均为20℃～30℃。（2）K⁺、Na⁺、Li⁺、Mn²⁺、Ca²⁺对两种重组单宁酶酶活影响不大;高浓度的Co²⁺对两种重组单宁酶酶活起到激活作用;Mg²⁺、Zn²⁺对Tanop重组单宁酶和Tanwt重组单宁酶激活作用最强,高浓度时（10 mmol/L）分别激活提高至294.62%、288.57%和303.49%、280.89%;Cu²⁺对两种单宁酶酶活均有强烈抑制作用;低浓度的Hg²⁺、Fe³⁺、Al³⁺对两种重组单宁酶酶活均为激活作用,高浓度（10 mmol/L）表现为抑制作用。（3）表面活性剂（吐温-80、曲拉通X-100、SDS）和抑制剂（EDTA、DMSO、DTT）对Tanop重组单宁酶和Tanwt重组单宁酶的活性均有不同程度的抑制作用,SDS的抑制效果最强。（4）有机试剂甲醇、乙醇、丙三醇、正丁醇、丙酮、乙腈对Tanop重组单宁酶和Tanwt重组单宁酶酶活均有不同程度的抑制作用,随着浓度增加,甲醇、乙醇、丙三醇的抑制程度变化不明显,而正丁醇、丙酮、乙腈的抑制作用明显增强,乙腈的抑制作用最强烈。异戊醇对Tanop重组单宁酶有一定抑制作用,但对Tanwt重组单宁酶有轻微促进作用。（5）以没食子酸甲酯为反应底物,Tanop重组单宁酶的K_m=8.84 mmol/L,V_max=0.094μmol/min,Tanwt重组单宁酶的K_m=11.12 mmol/L,V_max=0.022μmol/min。（5）研究比较了Tanop重组单宁酶和Tanwt重组单宁酶的空间构象,得出结果如下:（1）圆二色谱结果显示Tanop重组单宁酶二级结构比例为14.4%α-螺旋、26.6%β-折叠、24.3%β-转角、34.8%无规则卷曲;Tanwt重组单宁酶则含有18.6%α-螺旋、19.4%β-折叠、24.4%β-转角、37.6%无规则卷曲。Mg²⁺和Zn²⁺的添加均使这两种重组单宁酶的α-螺旋比例增加,β-折叠比例减小,可能引起单宁酶活性位点附近的构象发生改变。（2）傅里叶红外光谱结果显示密码子优化前后的重组单宁酶的主要基团特征吸收峰种类没有发生明显变化,也没有明显的特征吸收峰波长发生位移。Mg²⁺和Zn²⁺的添加引起了Tanop重组单宁酶和Tanwt重组单宁酶的酰胺Ⅰ带特征峰波长的蓝移和红外吸收强度的增加。（3）荧光光谱结果显示,Tanop重组单宁酶在波长334.4 nm有最大荧光强度1428.6,高于Tanwt重组单宁酶在波长335.2 nm最大荧光强度1187.5。表明密码子优化引起了重组单宁酶中色氨酸和酪氨酸在重组单宁酶构象表面中所处的微环境产生变化。而Mg²⁺和Zn²⁺的添加对两种重组单宁酶的色氨酸和酪氨酸微环境均有一定影响。以上所有研究结果表明:密码子优化对重组单宁酶的影响表现在以下几方面:（1）密码子优化能提高重组单宁酶的表达量及比酶活;（2）密码子优化对重组单宁酶的最适反应p H和p H稳定性、最适反应温度和温度稳定性、有机溶剂耐性无明显影响,但是密码子优化降低了表面活性剂和抑制剂对重组单宁酶酶活的抑制作用,提高了高浓度金属离子Mg²⁺、Zn²⁺对重组单宁酶的促进作用;（3）密码子优化引起了重组单宁酶空间构象的微小变化,如二级结构β-折叠比例的升高、荧光强度的增加等,是提高单宁酶比酶活的重要原因。