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前言脂毒性目前被认为是2型糖尿病的主要发病机制之一。生理条件下,一定的糖和脂对于胰岛功能的维持是必不可少的。但是,慢性持续性的高糖和／或脂信号干预胰岛β细胞却可以引起胰岛素基因表达受损,胰岛素合成、分泌减少及p细胞凋亡。一系列的研究都证实了脂肪酸在高糖环境下可以诱导胰岛p细胞凋亡。丝氨酸-苏氨酸激酶Akt,也称作蛋白激酶B(PKB),在调节胰岛β细胞功能和结构方面扮演重要的角色。不断有证据显示,PKB蛋白激酶通过磷酸化激活后可以保护胰岛β细胞抵抗糖脂毒性的毒副作用。对于胰岛p细胞来说,PKB不仅是生长因子信号、细胞因子及其它细胞刺激的关键的下游蛋白,也是胰岛素信号系统的关键靶点。Ghrelin主要是由胃底X／A样细胞分泌的,由28个氨基酸组成的生物性多肽,在第3位丝氨酸上带有辛酰化基团。作为生长激素促泌剂受体的内源性配体,它能够促进生长激素的分泌和调节食物摄取。Ghrelin的生物作用广泛,其中包括调节能量和糖代谢稳态,调节多种正常和肿瘤细胞株的增殖、凋亡和分化等功能。近年来,Ghrelin和胰岛β细胞之间的关系越来越受到关注。有学者发现在胰岛边缘可以检测到单纯分泌ghrelin的ε细胞,提示ghrelin不仅可以通过内分泌还可能通过旁分泌途径作用于胰岛β细胞。不断有证据指出,Ghrelin对胰岛细胞增殖、凋亡和功能的调节作用是通过生长激素促泌剂受体1a依赖或非依赖的机制介导的。Ghrelin能够促进胰岛β细胞的增殖、抑制干扰素y(IFN-y)联合肿瘤坏死因子a(TNF-a)诱导的或用阿霉素诱导的胰岛β细胞株的凋亡。PI3K/PKB信号通路目前被认为是介导Ghrelin在1型糖尿病中发挥保护作用的主要通路。而对于2型糖尿病的主要机制之一,脂毒性诱导的胰岛β细胞凋亡,Ghrelin能否通过相近的信号通路发挥保护胰岛β细胞的作用,有待于进一步的研究。因此,本研究的目的主要就是探讨ghrelin能否保护胰岛β细胞拮抗脂毒性的毒副作用以及探索相关的机制。材料与方法一、实验材料胰岛p细胞株MIN6第10～30代；胃饥饿素(Ghrelin),不含游离脂肪酸的牛血清白蛋白(BSA),棕榈酸(PA),Hoechst33258, MTT, PI3K/PKB阻断剂LY294002,JNK阻断剂SP600125；实验使用的蛋白抗体有PKB及其第473位丝氨酸磷酸化一抗,JNK1／2及其磷酸化一抗为兔多抗；TUNEL原位末端POD标记检测试剂盒；Caspase3活性检测试剂盒；细胞甘油三脂含量检测试剂盒；AnnexinV-PI双染凋亡检测试剂盒；PCR引物和RT-PCR检测试剂。二、实验方法1、细胞培养小鼠胰岛β细胞株-MIN6在高糖DMEM培养基和15%胎牛血清中于37℃、5%CO2条件下进行培养,培养基中加入100 U／mL青霉素,100μg/mL链霉素,100μg/mL L-谷氨酰胺,5μL／Lβ-巯基乙醇。细胞单层生长达80-85%培养面积后,用于实验或传代。2、细胞活性检测收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,铺96孔板使待测细胞调密度至5000细胞／孔,过夜贴壁后,进行实验干预。细胞活性检测用MTT法。实验干预后,每孔加入20μL MTT溶液,继续在5%C02,370C条件下孵育4h后,小心吸去孔内培养液。每孔加入150gL二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪570nm波长处测量各孔的吸光值。3、Caspase-3活性检测收集实验各组细胞(3×106／组),PBS洗二次,10,000 rpm/min离心1 min,去除PBS,沉淀细胞中加入100μL冰冷裂解液和1μL DTT,混匀。将细胞裂解物移入96孔板,每空加入5μL Caspase-3反应底物(DEVD-pNA),37℃孵育2h。分光光度计在405 nm波长测定其吸光值。4、TUNEL法检测细胞凋亡凋亡检测方法参照TUNEL原位末端POD标记检测试剂盒说明书进行,细胞爬片长至80%覆盖率后,进行实验处理。加入1 mL的4%甲醛溶液,4℃固定细胞10 min,弃去固定液,PBS洗二次,加入TUNEL反应混合液进行染色和50μLonverter-horse-radish peroxidase(POD);最后加入DAB反应底物和苏木素进行复染。光学显微镜下计数细胞凋亡。凋亡的细胞核呈现棕褐色或黑色；正常的细胞核用苏木素复染成蓝核。凋亡率=(凋亡细胞／全部细胞)×100%。5、Hoechst33258染色细胞爬片放置在6孔板中,加入1 mL的4%甲醛溶液,4℃固定细胞10 min,弃去固定液,PBS洗二次,滴加100μL Hoechst 33258(1 Oug/mL)工作液,室温染色10 min,流水冲净,于340nm波长的荧光显微镜下观察并计数细胞凋亡。凋亡细胞核染色质聚集或核碎裂。凋亡率=(凋亡细胞／全部细胞)×100%6、AnnexinV-PI双染,流式细胞仪分析收集细胞,用PBS轻轻重悬细胞并计数。取5万重悬的细胞,1000g离心5min,弃上清,加入195μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。加入5μLAnnexin V-FITC,轻轻混匀。室温(20-25℃)避光孵育10min。1000g离心5min,弃上清,加入190μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。加入10μL碘化丙啶(PI)染色液,轻轻混匀,随即进行流式细胞仪检测,Annexin V-FITC为绿色荧光,PI为红色荧光。7、电镜MIN6细胞在250mL培养瓶中长至80%,进行实验处理后,用2.5%戊二醛固定后收集细胞,制作电镜标本,进行观察。8、特殊染色法测细胞内甘油三脂含量应用甘油三酯检测试剂盒(GPO-POD)测定MIN6细胞胞浆甘油三脂含量。收集细胞,PBS冲洗两遍后在超声下裂解。将10 uL细胞裂解物或标准品移入96孔板。每孔加入200 uL甘油激酶,70 uL磷酸甘油氧化酶和显影剂。酶标仪500nm波长下测定吸光度值。绘制标准曲线,通过标准曲线计算胞浆甘油三酯含量。9、细胞总RNA的提取及RT-PCR检测应用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)半定量测定SREBP1c、CHOP、BAX、BCL-2和β-actin等基因的表达。提取细胞总RNA,用逆转录酶和hexamers合成cDNA。使用Primer5软件设计引物,送试剂公司合成。PCR扩增目的基因,在1.5%琼脂糖凝胶电泳分离形成目的条带,溴化乙锭染色成像；测定电泳条带密度值；扫描成像用Scion Image软件分析灰度值。10、Western blot(免疫印记)应用细胞裂解液提取细胞蛋白,测定蛋白浓度。制备10%聚丙烯酰胺凝胶,进行电泳,转膜,杂交。磷酸化PKB和JNK上样量为100ug,总PKB和JNK的上样量为50ug。ECL发光法测定目的条带,目的条带的灰度值用Scion Image软件分析。11、统计学分析应用SPSS 13.0软件进行单因素方差(ANOVA)统计分析,结果用均数±标准差(x±s)表示,组间差异比较采用Dunnett’s检验,P<0.05差异有显著性。实验结果一、脂毒性对胰岛p细胞的细胞活性、微观结构和诱导细胞凋亡的影响研究1、棕榈酸产生的脂毒性能够浓度依赖性地降低胰岛β细胞的细胞活性。2、棕榈酸的毒性使胰岛p细胞形态严重受损(电镜),核皱缩,染色质凝聚,内质网扩张,线粒体肿胀,胞浆中的分泌颗粒减少或消失。3、棕榈酸能够浓度依赖性地诱导胰岛p细胞凋亡。二、Ghrelin对胰岛p细胞脂性凋亡和甘油三酯沉积的影响1、应用MTT法检测细胞活性的结果显示,0.4mM棕榈酸干预胰岛β细胞24h明显降低细胞活性21%(p<0.05),而加用ghrelin具有浓度依赖性地拮抗棕榈酸诱导的脂毒性的功效,100nM ghrelin的作用最强,可以显著提高细胞活性达34%(p<0.01)。Caspase3活性测定的结果显示,0.4mM棕榈酸可显著增加Caspase3活性61%,而加用100nM ghrelin可降低Caspase3活性27%(p<0.05)。Hoechst33258染色法评估细胞凋亡可以看到,棕榈酸作用MIN6细胞24h使细胞凋亡率达到47%,而联用100nM ghrelin可显著降低凋亡率16%(p<0.01)。2、和棕榈酸(p<0.01)的作用相反,Ghrelin能够浓度依赖性的降低胰岛β细胞胞浆甘油三酯的含量。无论是在基础状态下还是脂毒性条件下,100nM具有降低胞浆甘油三酯的最大功效(p<0.05)。三、Ghrelin保护胰岛p细胞拮抗脂毒性的分子机制研究1、0.4 mM棕榈酸干预MIN6细胞24h明显抑制蛋白激酶B的磷酸化(p<0.01),加入100nM ghrelin能够快速诱导蛋白激酶B的激活,作用30min达到最大作用高峰(p<0.01)。Ghrelin浓度依赖性地促进蛋白激酶B的磷酸化激活,100nM的浓度产生最大的效力(p<0.01)。Ghrelin诱导的蛋白激酶B的激活能够显著地被PI3K阻断剂-LY294002所阻断(p<0.05)。而且,TUNEL法和Hoechst染色法检测凋亡证明,LY294002能够阻断ghrelin对胰岛β细胞脂性凋亡的保护作用。2、MIN6细胞用棕榈酸干预24h能够引起JNK磷酸化的激活(p<0.01),100nMghrelin能够在作用30min后引起JNK磷酸化显著意义地降低(p<0.05),而该降低的过程能够被PI3K阻断剂-LY294002所阻断(p<0.05)。JNK的阻断剂-SP600125,能够显著抑制棕榈酸诱导的凋亡。凋亡实验显示,联合应用SP600125和ghrelin能够产生最大保护MIN6细胞、防止凋亡的作用。3、同Caspase 3活性测定结果相一致,棕榈酸显著上调BAX、SREBP1c和CHOP-10的mRNA表达而下调BCL-2mRNA的表达；100nM ghrelin下调BAX、SREBP1c和CHOP-10的mRNA表达,但对BCL-2 mRNA的表达没有统计学意义上的影响。结论1、棕榈酸产生的脂毒性降低MIN6胰岛β细胞的细胞活性,引起细胞微观结构改变,浓度依赖性的诱导细胞凋亡。2、Ghrelin促进胰岛β细胞生长,提高细胞活性,抑制脂毒性诱导的细胞凋亡。3、Ghrelin保护MIN6胰岛β细胞株抵抗脂毒性和PI3K／PKB信号通路有关。4、Ghrelin减弱棕榈酸诱导的JNK磷酸化激活,JNK特异阻断剂-SP600125增强ghrelin保护MIN6胰岛β细胞株抗凋亡的作用。5、脂毒性条件下,Ghrelin的抗凋亡作用涉及线粒体途径。6、脂毒性条件下,Ghrelin减少胞浆内甘油三酯含量,抗脂毒性作用和内质网应激途径有关。