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锈赤扁谷盗Cryptolestes ferrugineus（Stephens）是一种世界性储粮害虫,目前针对锈赤扁谷盗的防治方法中最常用的是磷化氢熏蒸,近年来,锈赤扁谷盗对磷化氢产生了越来越严重的抗药性,锈赤扁谷盗对磷化氢的抗性问题已成为储粮害虫防治最棘手的难题。目前,锈赤扁谷盗对磷化氢的抗性机理仍不清楚。为了减少锈赤扁谷盗对粮食储藏造成的危害,对该虫抗药性机理的研究已迫在眉睫。细胞色素P450对昆虫杀虫剂有重要的代谢解毒作用,细胞色素P450基因的过量表达是许多昆虫对杀虫剂产生高水平抗药性的主要机制之一。本研究对全国多个地理种群的锈赤扁谷盗进行抗性监测和筛选,并在此基础上建立了不同抗性水平的抗性品系,包括极高抗品系、高抗品系、中抗品系等。对锈赤扁谷盗敏感和抗性品系体内P450酶活力测定,应用高通量测序技术对锈赤扁谷盗敏感和抗性品系进行转录组测序,并进行生物信息学分析,筛选出抗性相关的P450基因,然后对P450基因表达模式进行探究分析。主要研究结果如下:一、不同品系锈赤扁谷盗对磷化氢抗性水平测定采用FAO推荐方法对8个不同地理种群的锈赤扁谷盗进行生物测定试验,结果显示:敏感品系SS的LC50（95%置信区间）为0.024 mg/L,辽宁开原LNKY、海南三亚HNSY、浙江萧山ZJXS、河南沈丘HNSQ、北京中粮BJZL、广东中穗GDZS、山西吕梁SXLL这7个品系锈赤扁谷盗试虫均属于抗性品系,其中LNKY、HNSY、ZJXS、HNSQ和BJZL均属于极高抗品系,抗性倍数分别是敏感品系的206、236、473、511、942倍;GDZS抗性倍数是敏感品系的114倍,为高抗性品系;SXLL抗性倍数是敏感品系的17倍,为中等抗性品系。二、不同品系锈赤扁谷盗细胞色素P450酶活测定以SS敏感、SXLL中抗、GDZS高抗、HNSQ极高抗品系的锈赤扁谷盗为材料,测定了不同品系锈赤扁谷盗中细胞色素P450酶活。结果显示HNSQ、GDZS、SXLL品系的P450酶活分别是敏感品系SS的2.07、1.53、1.04倍。经磷化氢亚致死剂量LC30胁迫不同时间后,HNSQ品系的P450酶活在24 h时上升,48 h时P450的酶活性达到最高15.06（EU of P450）/μg;GDZS品系的P450酶活随着处理时间的延长呈增长趋势,酶活最高达到10.27（EU of P450）/μg;SXLL品系酶活最高达到9.20（EU of P450）/μg。结果表明,抗性品系的P450酶活力均高于敏感品系,且极高抗品系的P450酶活力高于高抗、中抗和敏感品系,说明锈赤扁谷盗对磷化氢的抗性与P450酶活性的增加有关。三、锈赤扁谷盗磷化氢抗性相关基因筛选通过对锈赤扁谷盗抗、感品系进行转录组测序分析,对锈赤扁谷盗敏感和抗性间差异表达基因进行筛选和分析,SS-VS-RS两组之间共筛选到7464个差异表达基因,其中包括6324个上调基因,1140个下调基因。通过Nr注释对差异表达基因经过比对分析,共筛选获得38条锈赤扁谷盗P450差异表达上调基因,4条P450差异表达下调基因,对38条表达上调基因构建系统发育树并进行分析,这些P450基因中有15条被准确分类到4个集团（Clan）,分别为CYP2 clan、CYP3 clan、CYP4clan及线粒体P450（Mitochondrion）clan中。四、抗性相关P450基因的定量分析采用实时荧光定量PCR（qPCR）进一步验证在抗、感品系中表达差值倍数log FC值大于1.5的7个P450基因的表达模式,结果表明,DN10621、DN4282、DN30828、DN1575和DN828在抗性品系HNSQ的表达量分别是敏感品系SS的10.33±1.07、15.82±0.27、25.05±1.53、4.69±1.11、5.48±0.97倍,在不同品系中DN27063的表达量在0.897～1.149倍之间;DN1830在不同品系中表达量较低,表达量在0.198～0.768倍之间。对不同差异表达基因的表达量进行分析后发现,DN10621、DN4282、DN30828、DN828这4个基因均在锈赤扁谷盗抗性品系中过量表达,DN1575仅在极高抗品系中过量表达,表达量显著高于中抗和敏感品系。对抗、感品系锈赤扁谷盗进行磷化氢的亚致死浓度LC30胁迫处理后,对五个P450基因做进一步的表达量试验验证,结果显示,DN30828、DN828、DN4282等3个基因均有不同程度的表达量上调,其中DN828和DN4282两个基因在磷化氢胁迫处理48h过程中整体上出现先下降后上升的趋势,分别在磷化氢胁迫处理2 h和12 h时达到峰值,随后略有下降且抗性品系中表达量均高于敏感品系,因此,细胞色素P450基因的过量表达可能与锈赤扁谷盗磷化氢抗性有关。五、锈赤扁谷盗DN4282和DN828基因的克隆及序列分析根据转录组测序序列设计引物,扩增获得锈赤扁谷盗DN4282、DN828和DN30828基因序列,并分别被命名为CYP4XU1、CYP4XV1、CYP6ZK1。DN4282的ORF为1494bp,共编码497个氨基酸。DN828的ORF为1506 bp,编码501个氨基酸。DN4282基因编码的蛋白质分子式为C2639H4156N690O726S19,蛋白质分子量为57.78 KDa,理论等电点为8.74。DN828基因编码的蛋白质分子式为C2657H4215N691O728S21,蛋白质分子量为58.16 KDa,理论等电点为8.96。系统进化树分析显示,DN4282、DN828均与CYP4家族聚为一支,与赤拟谷盗T castaneum,灰飞虱Laodelphax striatellus,黄粉虫Tenebrio molitor等的同源性较高。