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研究背景腹腔粘连为手术后常见并发症之一,尤其是剖腹术后,其症状多表现为体内脏器之间或与腹膜之间的粘连,有时以条带状态出现,导致病人产生不适或疼痛感,并有可能引发女性不孕,严重时腹腔内脏器大面积粘连,形成类似包裹在粘膜内的团块状粘连并与腹膜相连,阻碍正常肠蠕动过程,导致患者产生肠梗阻现象。近年来腹腔镜技术的发展在一定程度上减少粘连发病率,减轻粘连的发病程度,但是仍有病人在腹腔镜手术后产生粘连问题。虽然腹腔粘连可以通过粘连松解术缓解,但复发的几率很大,并且腹腔松懈术本身对机体带来的损伤也可能产生新的粘连。因此,寻找非手术性治疗粘连的方法是粘连预防和治疗的重点。维通静脉乳剂(Weitong Intravenous Emulsion,WIE)的研究是南方医院药学部在前期研究维通注射液的基础上进一步的延伸,与注射液相比,静脉乳剂对注射液中的组方配比重新进行了筛选和配比。由于使用了乳剂形式,有效增加组方中脂溶性药物的溶解度,术后静脉滴注维通静脉乳可以解决术后禁食限制导致无法使用口服抗粘连制剂的问题,有利于快速激活体内纤溶系统活性,并抑制炎症反应,帮助患者尽早恢复身体健康。目的通过处方前研究、处方设计、工艺优化制备维通静脉注射乳剂,研究维通静脉乳剂制剂在各种不同环境因素影响下的稳定性,使用安全性评价研究维通静脉乳剂的毒性作用,使用动物药效学实验评价维通静脉乳剂对腹腔粘连的防治作用,运用分子生物学技术研究维通静脉乳抗粘连的机制。方法1维通静脉注射乳剂(WIE)处方前研究1.1 WIE的主要组成成分DA和DB的含量测定方法的建立DA色谱条件的建立：色谱柱：C18,流动相：甲醇-水(85：15),流速：1.0mL·min-1,柱温：30℃,进样量：20μl,检测波长：270nm;回归方程为：Y=0.00001273X+0.012698,R2：0.9999448,精密度0.13%,说明方法良好,测得样品含量984.8 mg·g-1。DB色谱条件的建立：色谱柱：C18,流动相：乙腈-0.6%磷酸水溶液(40：60),流速：1 mL·min-1,柱温：300C,进样量：20μl,检测波长：220 nm,回归方程为：Y=0.0002361X+8.887164,R2=0.9998243,精密度考察结果为0.49%,符合药典要求,样品含量测定结果为981mg·g-1。1.2 DA、DB在剧烈条件下的稳定性实验将DA、DB置于不同环境中,分别研究温度对稳定性的影响、光照对稳定性的影响、氧化环境对稳定性的影响、酸性环境对稳定性的影响、碱性环境对稳定性的影响。2维通静脉注射乳剂处方设计及制备工艺研究2.1处方设计根据预实验的结果,我们实验选择大豆油、中链甘油三酯(MCT)混合构成注射用油,选择卵磷脂作为乳化剂,使用油酸作为稳定剂,并加入抗氧化剂维生素E、等渗调节剂甘油后进行正交实验,得出最佳配比。2.2制备工艺研究在固定处方的基础上,进行工艺研究：在高压灭菌实验我们使用105℃/30min,115℃/25min,121℃/20min3种条件进行实验,发现只有105℃/30min条件未破乳,故选为最佳灭菌条件；在该条件下进一步研究热压灭菌对pH的影响,发现乳剂pH在高压灭菌后会降低,故在制备WIE时需调节pH至9.0；不同均质压力和次数实验发现,随着均质次数的增加,静脉乳粒径的变化逐渐减小,最后趋向于一个恒定值,一般情况下均质3到4次后粒径大小和该值相差不大；对制备过程中混合温度,混合时间,均质压力进行正交实验得到最佳制备工艺。3维通静脉注射乳剂质量考察研究3.1维通静脉注射乳剂理化性质研究使用激光散射技术测定粒径与粒径分布,使用库尔特粒径测定分析仪测定WIE表面电位,使用乌氏粘度计测量WIE粘度。3.2维通静脉注射乳剂稳定性研究稀释稳定性实验：分别使用生理盐水、葡萄糖稀释WIE 20倍,在Omin, 30min,1h,2h,4h,8h,12h,24h后测量WIE平均粒径,观察外观：振摇实验：于25℃恒温水浴振荡器中,100rpm条件下振摇WIE,分别在2h、6h、12h、 24h、48h、72h取样,观察各取样时间下乳剂的性状,测定其平均粒径；离心加速实验：5000r/min离心30min,观察离心前后乳剂外观变化,粒径变化；低温实验：在4℃冷藏条件下放置10天,分别于0天、第5天和第10天取样,观察供试品外观变化情况,粒径变化情况；加速实验：在30-C条件下放置WIE6个月,分别于0月、1月、2月、3月、4月、5月、6月时取样,观察供试品外观变化情况,粒径变化情况。4维通静脉注射乳剂安全性评价4.1维通静脉注射乳剂溶血试验取7支试管,编号,分别在各管内加入适量2%红细胞混悬液和生理盐水(7号管内加蒸馏水做阳性对照),置于37℃恒温水浴中30min后又分别加入不同量的WIE(6号管做空白阴性对照),轻摇至均匀后放回37℃恒温水浴中,在第0.5、1、2、3h观察试管内红细胞溶血情况。4.2异常毒性试验将WIE(DA含量0.3mg·mL-1) 0.2mL/10g注入小鼠尾静脉。小鼠由尾静脉注射WIE后,48h内密切观察小鼠活动及饮食情况表现是否异常。4.3最大给药量试验将小鼠称重编号记录后,随机分成3组,每组10只(雌雄各半),3组分别为：维通静脉乳剂组,空白静脉乳载体组,生理盐水组。维通静脉乳组按照0.2mL/10g剂量尾静脉注射WIE,间隔10h再次给药,一共2次给药。空白静脉乳组,生理盐水组分别同样按照0.2mL/10g体积注射,注射方法与时间与WIE组相同。静脉注射给药后4h内密切观察,以后每天观察1次,连续观察14天,详细记录中毒症状、外观体征和死亡情况,每天称重1次并记录。实验结束时,各组动物摘眼球取血,在南方医科大学南方医院检验科进行血液常规(RBC、 WBC、HGB、PLT、白细胞分类等1测定。5维通静脉注射乳剂药效学评价5.1维通静脉注射乳剂抗腹腔粘连实验40只雄性Wistar大鼠按体重进行随机区组分组,共分4组(n=10)：模型对照组、地塞米松组、WIE高、低剂量组。对照组每日注射生理盐水1mL·kg-1,地塞米松组每日注射3mg·kg-1,高、低剂量组分别注射相当于0.3mg·kg-1、 0.1mg·kg-1DA量WIE。术后第7天(1)分别进行粘连程度分级评分； (2)腹主动脉,头皮针穿刺采血3mL至肝素钠抗凝管,3000rpm离心10min,分离血浆,储存于-70℃超低温冰箱待测；(3)用眼科剪剪取粘连部位腹壁组织(0.5*0.5cm),置于冻存管中,标号后投入液氮中急冻,待完全冻结后放置于-70℃冰箱保存。5.2血浆内tPA、PAI含量测定使用酶联免疫吸附剂测定法测定各组大鼠血浆中组织纤溶酶原激活剂(Tissue Plasminoge Activator, tPA)、纤溶酶原活化抑制因子(Plasminogen Activator Inhibitor, PAI)蛋白含量。5.3实时荧光定量PCR法测定腹壁粘连部位tPA、PAI-1、COX-2 mRNA表达提取组织RNA,逆转录出cDNA,实时荧光定量PCR(QPCR)法检测WIE对各组大鼠tPA、PAI-1、环氧化酶2(COX-2)mRNA表达水平的影响,以β-actin为内参引物,结果以2-ΔΔCT方法分析基因相对表达量。结果1维通静脉注射乳剂(W1E)处方前研究建立DA和DB的含量测定方法,稳定性研究结果显示：DA在40℃时稳定性较好,标准品色谱图与储备液相比几乎没有变化,由DB色谱图可以发现,DB在40℃放置5天色谱图中出现杂峰,说明不能长期高温保存；DA经光照后其色谱图出现降解峰,说明DA对光照较为敏感,需要避光保存,因此我们在储存DA时始终保持避光。DB对光照也十分敏感,光照第5天及第10天色谱图中均出现大量杂峰；DA在强氧化环境出现降解峰,说明DA在强氧化环境内不稳定,因此在后续制剂过程中需要注意避免氧化现象出现,强氧化环境对DB也有较大影响,DB主峰出现变化且出现大量杂峰,因此DB也应避免接触强氧化性环境；对DA色谱图研究发现,在酸性环境下DA不稳定,有较大的降解峰出现,但是在碱性环境下,DA较为稳定,说明偏碱性环境对DA无影响。DB在强酸和强碱环境下均不十分稳定,因此在制剂时应注意保持中性或弱酸弱碱环境。2维通静脉注射乳剂处方组成及制备工艺称取DA 2mg,分散于混合油相中(MCT 10g,大豆油10g),加入油酸0.06g,维生素E 0.5g,60℃磁力搅拌溶解,制得油相。称取20mg DB,1.2g蛋黄卵磷脂,2.5g甘油,分散于60mL水相(注射用水)中,60℃搅拌溶解,制得水相。高速剪切搅拌(9500转/min)于60℃条件下,将油相缓慢滴加入水相中,共剪切约10min,,用注射用水稀释定容至100mL,制得初乳。转移至高压均质机中,以20000psi压力均质4次,装瓶,以0.1mol·L-1氢氧化钠溶液调节pH值到9.0,充氮,密封,105℃高压灭菌30 min,冰水浴迅速降温,即得。3维通静脉注射乳剂质量考察研究3.1维通静脉注射乳剂理化性质研究维通静脉注射乳剂理化性质研究结果发现WIE平均粒径为191.03±2.81mm,多分散指数0.11±0.01,平均表面电位为-37.5mV,测得其平均粘度为1.85 mpa-s。3.2维通静脉注射乳剂稳定性研究对WIE进行振摇实验,离心加速实验,低温实验和加速实验,实验结果证明在不同因素的影响下,WIE性状保持稳定,未见分层,粒径、多分散指数、强度径及体积径均未发生明显改变。4维通静脉注射乳剂安全性评价4.1维通静脉注射乳剂溶血试验在各个时间点1-5号管均未发生溶血现象,说明WIE无溶血作用,阴性对照组的6号管也无溶血现象。7号管在各个时间点均发生溶血现象。因此,本实验制备的WIE渗透压在安全范围内,且不含溶血成分,作为注射剂可以安全使用。4.2维通静脉注射乳剂异常毒性试验尾静脉给药后我们发现小鼠活动及饮食行为正常,均无异常反应,且在给药后48h内无1例死亡。实验结果说明WIE无异常毒性。4.3维通静脉注射乳剂最大给药量试验最大给药量给药后除WIE组给药后第1天粪便呈暗红色外,其它组动物各项体征均正常。小鼠体重从开始注射前到注射14天后两周内各组间无显著性差异。血常规检测结果：经单因素方差分析发现与红细胞相关的血红蛋白测定(F=4.773,P=0.017)、红细胞比积(F=6.227,P=0.006)、平均红细胞体积(F=5.682,P=0.009)、平均红细胞血红蛋白量(F=6.486,P=0.005)4组数据P值小于0.05,不同给药组间存在显著差异,其余血常规指标中各组间P值均大于0.05,未见显著差异。5维通静脉注射乳剂药效学评价5.1维通静脉注射乳剂抗腹腔粘连实验术后第7天考察各组大鼠腹腔粘连情况发现,所有给药组粘连程度同模型组比较均有显著改善。WIE高剂量与地塞米松组的作用相似,无显著性差异。WIE低剂量作用较弱,同WIE高剂量组间存在显著差异,同地塞米松组间亦有显著性差异。5.2血浆内1PAI含量测定对血浆内tPA蛋白水平考察发现WIE可有效提高血浆内tPA含量。同模型对照组相比,地塞米松组和高、低剂量WIE组在术后第7天大鼠血浆tPA蛋白含量均明显上升(P<0.05)。高剂量组tPA蛋白水平显著高于其它3组；对PAI蛋白水平考察发现模型对照组PA1蛋白水平显著低于其他3组(P<0.05)。WIE高剂量组、WIE低剂量组及地塞米松组3组之间PA1蛋白水平无显著性差异(P>0.05)5.3 QPCR法测定腹壁粘连部位tPA、PAI-1、COX-2 mRNA表达使用QPCR方法对tPA mRNA表达水平研究发现：与模型对照组相比,tPAmRNA相对表达量各组均显著升高(P<0.05),高剂量WIE组mRNA表达与低剂量WIE组和地塞米松组比有显著差异(P=0.000)；地塞米松组与低剂量WIE组mRNA表达有显著性差异(P=0.000)；对PAI mRNA研究发现：模型对照组PAI mRNA相对表达量与其它各组相比差异均有有统计学意义(P<0.05),高剂量WIE组与低剂量W1E组和地塞米松组3组间PAI mRNA表达水平无显著差异(P>0.05)；对COX-2 mRNA研究发现：与对照组相比,其它各组的COX-2 mRNA相对表达量显著降低(P<0.05),高剂量WIE组mRNA表达同地塞米松组tPA mRNA表达水平比较无显著差异(P=0.996),与低剂量WIE有有显著差异(P=0.085)； 地塞米松组与低剂量WIE组mRNA表达有显著性差异(P=0.039)；结论1 实验考察了各种外界多种因素对WIE主要成分DA和DB的影响,研究结果表明,对DA而言,光照、氧化和酸性环境影响较大,其它因素影响较小,对于DB而言,各种剧烈因素均有影响,因此无论在原料药保存和制剂的保存都要使用避光,低温的温和保存环境,而在制剂生产过程中,要注意光照、氧化等因素的干扰,提前加以预防。2 WIE的组成为：DA 0.002%, DB 0.02%,混合油相(MCT10%,大豆油10%),油酸0.06%,维生素E 0.5%,蛋黄卵磷脂1.2%,甘油2.5%。混合、高速剪切后通过高压均质,灭菌等步骤制得。3维通静脉注射乳剂理化性质符合静脉乳要求,各项指标正常,各项稳定性指标检测证明其性质稳定。4溶血试验、异常毒性试验、最大给药量试验证明WIE安全性好,毒性较小。5药效学实验证明WIE可有效的对抗术后粘连的形成,有效调节血浆tPA、PAI蛋白水平和腹壁粘连部位tPA、PAI、COX-2基因表达水平。