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肿瘤基因治疗中为了获得肿瘤特异靶向性，可以使用特异性启动子在转录水平控制目的基因的表达水平。目前骨肉瘤基因治疗中已有使用组织特异性启动子(骨钙素启动子)驱动治疗基因的报道，但骨钙素启动子不能分辨正常的骨组织和骨肉瘤从而产生活性泄漏现象有导致严重毒副作用的危险。近年来人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)基因的启动子已被证实在90％以上的人类肿瘤组织中活性上调，现成为肿瘤基因治疗中转录靶向的研究热点。已有人尝试使用hTERT启动子靶向治疗骨肉瘤。但单纯使用天然启动子并不能满足肿瘤基因治疗高选择性，高活性的要求，为了更精确的定位治疗基因的表达，可以使用不同种类的启动子／增强子中的正性或负性调控元件人工构建新型的嵌合启动子。根据骨肉瘤细胞中端粒酶活性上调和c-MYC蛋白高表达的分子生物学特性，我们使用MYC反应元件修饰hTERT启动子以求进一步增强该启动子在骨肉瘤组织中的活性及表达特异性。 病毒介导的酶解前体药疗法(virus-directed enzyme prodrug therapy，VDEPT)因其转染效率高，毒副作用小的特性近年来已成为肿瘤基因治疗研究中的一个热点。为了在骨肉瘤基因治疗中有所突破，我们采用MYC反应元件修饰hTERT核心启动子并使用Cre重组酶／loxP腺病毒载体系统成功 第四军医大学硕士学位论文构建了该饭合启动子引导酵母源性胞g密咬脱氨酶FCy基因和虫荧光素酶luciferase表达的复制缺陷型腺病毒，并半定量的评估了修饰后启动子的活性水平。目前国内外尚无门类文献报道。 一穿梭质粒的构建 按照设计将构件串联＊＊C反应元件修饰卜＊＊＊T核心启动子序列，并将构建的启动于序列以及目的基因，酵母源性胞咯吱脱氨酶FCy基因和虫荧光素酶luciferase，克隆到腺病毒试剂盒提供的穿梭质粒＿卜。 二复制缺陷型腺病毒的重组及扩增 将串联MYC反应元件修饰hTERI”核心启动子引导酵母源性胞啼l在脱氨酶Fcyl基因或虫荧光素酶luciferase的穿梭质粒分别与其辅助质粒共转染HEK 293细胞，在转染后7刁 0天HEK 293细胞均出现了典型的细胞病变反应，即细胞交圆、折光性增强并从培养板底脱落。收集上清，再次感染HEK293细胞，3－4天后出现了CPE，收集上清。 三复制缺陷型腺病毒的鉴定 根据h 基因和荧光素酶基因序列自行设计引物，取病毒上清作模板，PCR反应结束后将产物进行琼脂糖凝胶电泳，在FCy组的4种重组病毒中均扩增出了1H加的目标片段，在荧光素酶组的4种重组病毒中均扩增出了31 Zbp的目标片段，证实获得了重组腺病毒。 四 复制缺陷型腺病毒的滴度测定 斑3以成实验是测定腺病毒滴度的生物学方法，我们采用斑形成实验对扩增后的重组腺病毒进行了滴度测定，根据：病毒滴度一斑数量／（稀释系数X加入病毒稀释液体积）计算出病毒液度值。 五胶合启动子活性的半定量研究 （重组腺病毒厂cy组wcyl的mRNA在骨肉瘤细胞中的表达） 将FCyl组的重组腺病毒调整滴度后，分别感染人骨肉瘤细胞MG63，48h后提取细胞总RNA，RT－PCR后将产物进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶图像分 6 第四军医大学硕士学位论文析系统对其进行分析，以Fcyl与内参6仓ctin扩增产物的光密度比值来反映各样品 Fcy m］INA的表达水平，从而比较启动于的活性水平。结果表明：串联MYC反应元件修饰后的hi卫RT核心启动子的活性明显增强，但MYC反应元件的数量与启动子的活性之间并不总是成正比，修饰后的启动子的活性也许还与修饰元件距离启动于的远近有关。 以上的结果为进一步定位及定量研究这种新型的根合启动子活性。MYC反应元件重复序列的数量及其与hTERT核心启动子的距离对重建后启动于活性的影响、嵌合启动于引导FCyl靶向表达对骨肉瘤细胞的杀伤能力和毒副作用等奠定了坚实的基础。