论文部分内容阅读
随着人们环境意识的增强,环境友好的生物农药的发展受到了越来越高的重视。因此,利用昆虫病原微生物加工而成的微生物杀虫剂得到了较为广泛的应用。昆虫病原真菌罗伯茨绿僵菌(Metarhizium robertsii)、蝗绿僵菌(M.acridum)和球孢白僵菌(Beauveria bassiana)等作为害虫生物防治微生物不仅广泛运用于不同害虫的防治,已经逐渐成为研究昆虫-真菌相互作用的理想模型,关于其致病相关蛋白的功能与作用机理的研究不仅具有重要的理论意义,对于提高真菌杀虫剂的应用效率也具有重要的应用价值。本论文就罗伯茨绿僵菌(下简称绿僵菌)中细胞自噬、脂代谢相关蛋白开展了功能研究,同时通过脂滴分离,开展了高通量的脂滴蛋白质组及全细胞脂质组分析,揭示了细胞自噬与脂代谢及真菌杀虫毒力之间的关联性。 细胞自噬在真核生物中高度保守,在生物体一系列的生理过程中扮演着非常重要的角色。自噬过程主要分为四个阶段:自噬的诱导、自噬小体形成所需膜结构的延伸、自噬小体的成熟以及最终的降解,众多自噬相关蛋白参与其中。以绿僵菌为对象,通过对参与细胞自噬不同阶段的相关蛋白基因开展功能分析,结果表明,缺失Mratg1(MAA_03501),Mratg4(MAA_04475),Mratg8(MAA_02674)和Mratg15(MAA_00506)都会导致分生孢子中脂滴积累的减少和杀虫毒力的降低,但仅有Mratg8影响侵染结构附着胞的分化。我们还证明了脂滴特异性的脂被蛋白Mpl1在四个基因敲除转化子的分生孢子中的表达水平明显下降,这也与脂滴积累下降的实验结果一致,揭示了自噬对脂代谢的影响。 磷脂酰胆碱是包括细胞、脂滴、自噬小体在内众多膜结构的主要成分,其合成依靠CDP-胆碱和PEMT通路两条途径。我们通过基因敲除,对在这两条途径中起关键作用的酶Mrpct(MAA_00035)和Mrpem(MAA_06426)进行了功能研究。结果表明,除了对脂滴、甘油三酯的积累以及杀虫毒力产生影响外,Mrpct或者Mrpem的敲除还会导致菌体细胞自噬水平的改变,进一步体现了脂代谢与细胞自噬的关联性。 对不同培养条件下的绿僵菌菌丝进行脂滴分离,开展了高通量的脂滴蛋白组及全细胞脂质组分析及比较,结合细胞生物学、分子生物学以及生物化学等手段,主要结果包括:1)不同营养条件下,脂滴蛋白的累积水平存在显著差异,尤其是氮饥饿条件诱导细胞自噬相关的蛋白水平发生了显著变化;2)证明部分自噬相关蛋白定位于脂滴;3)发现营养状态的改变,以及自噬过程的抑制都会引起绿僵菌菌丝中磷脂成分的变化,同时磷脂成分的构成也影响细胞自噬过程,从而进一步揭示了研究细胞自噬和脂代谢之间的关联性。 综上所述,我们通过基因缺失、生物化学及生物测定等分析,揭示了细胞自噬对于绿僵菌生长、分化和侵染昆虫能力的影响;通过比较蛋白组学、脂质组学分析,证明了细胞自噬和脂代谢之间存在关联性。这些研究成果提高了以丝状真菌为模型的细胞自噬相关的机理认识,为更进一步开展自噬和脂代谢的关联性及机理研究奠定了良好的基础。