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质膜Ca2-ATPase(plasma membrane Ca2+-ATPase，PMCA)是真核生物细胞膜上维持胞内Ca2+动态平衡的重要分子，其活性与功能受到细胞内多种脂质及蛋白质的调控。近年的研究表明，PMCA是脂筏相关蛋白，并可作为细胞信号通路的“调节者”参与细胞内重要生理活动的调控。本论文从纯化的PMCA蛋白、重组脂酶体及完整细胞等不同层次，分别从脂筏中重要的脂类成分对PMCA活性的影响，以及脂筏参与PMCA及神经型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)活性调控这两方面进行了研究。主要内容如下：
1.脂筏重要脂类成分鞘磷脂和胆固醇对PMCA活性的影响
在实验室已有的工作基础上，优化了从红细胞中高效纯化PMCA的实验方法，得到了毫克级具有高活性的蛋白。以纯化PMCA蛋白为材料，在重组脂酶体水平研究了脂筏中重要的脂类成分鞘磷脂和胆固醇对PMCA活性的影响。实验结果表明，在富含鞘磷脂和胆固醇、流动性较低的“刚性”膜脂环境中，PMCA的活性受到抑制；而在流动性较高、结构较为松散的“柔性”甘油磷脂环境中，PMCA具有较高活性。此外，鞘磷脂和胆固醇还可拮抗磷脂酰丝氨酸等酸性磷脂对PMCA的激活作用。
2.脂筏与PMCA4b参与调控nNOS活性的研究
PMCA的四种亚型及nNOS在大鼠多个脑功能区中均有表达。我们以高水平表达内源nNOS、PMCA的原代大鼠小脑颗粒神经元，以及转染了外源nNOS、PMCA4b基因的HEK-293细胞为实验模型，对PMCA4b与nNOS的胞内定位、动态相互作用及酶活性进行研究，在完整细胞中确定了PMCA4b是调控nNOS去活化的重要分子，并从细胞水平探讨了脂筏结构完整性对PMCA与nNOS相互作用、酶活性及功能偶联的影响。
实验结果表明，nNOS分布在胞浆中，在靠近细胞膜的区域与膜蛋白PMCA4b存在部分共定位；这种空间上的接近为二者发生相互作用提供了基础。利用时间分辨荧光共振能量转移技术(FRET)，在活细胞中观察到当PMCA4b及nNOS被细胞内Ca2+浓度升高的信号激活时，PMCA4b与nNOS会发生蛋白质一蛋白质相互作用。这种相互作用是一个依赖于钙信号的动态过程，随着细胞内Ca2+浓度降低，蛋白质-蛋白质相互作用也随之解除。还发现PMCA4b与nNOS的相互作用依赖于nNOS的PDZ结构域和PMCA4b的PDZ结合位点。通过上调HEK-293细胞中PMCA4b的表达，发现细胞中PMCA的活性越高，nNOS的去活化越快。以上结果说明在细胞被钙信号激活的情况下，PMCA4b可以通过与nNOS发生蛋白质-蛋白质相互作用而参与nNOS活性的负调控。
通过对大鼠前脑突触质膜脂筏的分离与鉴定，发现PMCA4亚型在脂筏中相对富集，并在完整细胞中观察到PMCA4b与脂筏的标志性蛋白eaveolin-1存在部分共定位。在此基础上，利用环糊精MβCD处理细胞、破坏质膜的脂筏结构后，发现PMCA4b与nNOS不再发生相互作用，且二者的酶活性均显著降低。在无细胞体系中MβCD对PMCA和nNOS的活性没有直接影响，表明MβCD并不能够直接抑制二者的酶活性。这些结果提示在完整细胞中PMCA4b与nNOS的激活及二者间发生相互作用都依赖于细胞膜脂筏的完整性。
综上所述，本论文的研究结果表明，在细胞内钙信号激活的条件下，PMCA4b能够与nNOS发生蛋白质-蛋白质相互作用，并参与调控nNOS的去活化；富含鞘磷脂和胆固醇的细胞质膜脂筏为PMCA4b与nNOS提供了发生相互作用及功能偶联的平台。