糖原磷酸化酶基因在中国卤虫胚胎发育和温度胁迫过程中的表达模式

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中国卤虫(Artemia sinica)是一种广温、广布的小型甲壳动物,以卵生或卵胎生的方式进行繁殖。在外界环境胁迫的条件下,中国卤虫以产卵的繁殖方式可以产下休眠卵,这种休眠卵是处于滞育期的原肠胚,滞育胚胎对抵抗不利环境、扩大种群繁殖有重要意义。糖原在动物体内,除了作为能量贮备外,还参与许多大分子的合成。在糖原的代谢过程中,糖原磷酸化酶(GPase)催化糖原降解,它促使糖原从非还原端依次移去葡萄糖残基。在滞育昆虫中,糖原代谢与温度有关,GPase是糖原合成山梨醇的关键酶。目前在甲壳动物中,有关GPase的报道很少,在中国卤虫的胚胎发育以及温度胁迫方面更是未见报道。因此,本实验深入研究了GPase在卤虫滞育和滞育解除、早期发育和温度胁迫过程中的作用,为进一步研究卤虫滞育过程中的分子机制、进一步开发利用卤虫资源等方面,提供一定的理论参考并具有潜在的应用价值。本研究以RACE技术得到中国卤虫GPase基因全长,利用生物信息学技术对GPase基因进行分析,并采用原位杂交技术观察GPase基因在中国卤虫胚胎发育时期的表达部位,以实时荧光定量PCR技术研究GPase在中国卤虫胚胎发育不同时期以及温度胁迫实验中的表达量。实验结果显示,GPase基因全长为2790bp,序列包括2562bp的开放阅读框,61bp的5’非编码区和167bp的3’非编码区。经过生物信息学分析,预测该GPase蛋白含有853个氨基酸,分子量为98.19kD,理论等电点5.67,包含phosphorylase结构域,属于GTB型糖基转移酶超家族。经过序列比对和构建进化树分析,GPase在进化过程中比较保守。通过原位杂交实验证明,在不同发育时期,实验组均发现杂交阳性信号,并且表达部位具有广泛性。通过荧光实时定量PCR的实验可以观察到,GPase在不同发育时期,均有表达,但相对表达量有显著变化。GPase在0h和5h具有很高的表达量,随后显著下调,并且维持在一个很低的水平,直到第3d才开始有小幅度的上升趋势。在温度胁迫条件下,GPase的表达量首先伴随着温度的下降而下降,之后从15℃开始,伴随着温度的下降而表现上升趋势。这些结果说明,GPase不仅在卤虫胚胎发育过程中起重要作用,并且是一种温度相关基因,可能参与抗寒能力的调节。
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