论文部分内容阅读
研究背景：1997年,一个科学小组意外获得一种基因变异的小鼠。这种小鼠的表型同人类衰老表型很相似,因此将这一小鼠以希腊神话中主管生命长度的女神klotho命名。klotho变异纯合子(kl/kl)小鼠出生三周内并没有表现出与野生型小鼠不同的表型。出生三周以后表现为明显的发育停滞,严重的血管壁钙化,皮下脂肪萎缩,肺气肿,骨质疏松,缺少发育成熟的生殖系统,寿命缩短等酷似人类衰老现象的表型。肾脏是Klotho蛋白的主要表达场所,大脑脉络丛也少量表达Klotho蛋白。Klotho蛋白有两种存在形式。一种是单次跨膜蛋白,作为FGF23受体的共同受体而发挥作用。FGF23属于Fibroblast Growth Factor家族,主要来源于骨组织。在肾近曲小管上皮细胞表面存在FGF23的受体。在Klotho存在的条件在,FGF23特异性的和它的受体结合,激活下游信号通路,抑制原尿中磷的重吸收,从而维持血液循环中磷的生理浓度。FGF23与受体结合后还可以抑制合成活性维生素D的关键酶Cyp27b1,从而抑制活性维生素D的合成。因此,同FGF23-deficient小鼠相似,kl/kl小鼠也表现为高血磷和高血活性维生素D。Klotho蛋白的另一种存在形式是作为一种分泌蛋白。与细胞膜结合的Klotho在一些膜锚定蛋白酶,比如ADAM10、ADAM17或者BACE1,的水解作用下,将自身膜外部分解离并释放到血液,尿液或者脑脊液中,作为游离的体液因子参与到各种病理生理现象中。肾间质纤维化(Renal tubulointerstitial fibrosis, RTF)是各种慢性肾脏疾病(CKD)的最终病理表现。主要表现为细胞外基质(ECM)累积,成纤维母细胞的激活并伴随着有功能肾单位的减少。小鼠单侧输尿管结扎(unilateral ureteral obstruction, UUO)是人CKD的动物模型。UUO施术后,尿液淤积在肾盂内,压迫导致肾小管扩张,管型形成,炎细胞浸润,局部炎性因子表达升高,肾小管间质纤维化等,很好的模拟了人类慢性肾脏病的局部肾脏表现,是研究人类CKD的理想动物模型。近几年的研究表明Klotho蛋白在RTF发展过程中发挥着重要作用。比如Klotho在CKD病人的肾脏中表达下调,并且它的下调水平同疾病的严重程度成正相关。在kl/kl小鼠肾脏中,炎性因子和纤维化标记性因子表达均上调。UUO术后,klotho变异杂合子(kl/+)小鼠较野生型小鼠肾脏纤维化和各种炎性因子上调程度更为严重。另有很多报道,外源性Klotho蛋白能够显著缓解各种原因导致的肾脏损伤。因此,现有的研究都支持Klotho蛋白是一种肾脏保护蛋白。Klotho蛋白被认为能够拮抗UUO术后TGF-β信号通路和Wnt/β -catenin信号通路的激活,从而缓解UUO导致的RTF。已有的报道都是利用kl/+小鼠和野生型小鼠UUO术后对于RTF的比较,很好的支持了这一结论。然而不同于野生型和kl/+小鼠,kl/kl小鼠具有完全不同的表型,其中循环中显著升高的磷,活性维生素D3和FGF23浓度是最为典型的特征,也就是说kl/kl小鼠处于严重的内环境紊乱状态。有报道指出活性维生素D3和它的异构体也是一种肾脏保护因子。比如,在人子宫平滑肌瘤中活性维生素D3能够抑制TGF-β诱导的纤维化标记的基因表达；活性维生素D3的异构体maxacalcito能够将PPM1A/VDR复合体募集到pSmad3上加速后者的去磷酸化。也就是说在kl/kl小鼠中活性维生素D3的升高和Klotho蛋白的不足在RTF发展中的作用是相反的。至今为止还有没有高血磷和高血FGF23对于肾脏纤维化影响的报道。因此,kl/kl小鼠UUO施术后,紊乱的内环境是否会影响肾脏纤维化的发生发展,我们不得而知。目的：1.本课题以kl/kl小鼠为模型,研究UUO诱导的肾脏纤维化和Klotho缺失以及内环境紊乱的关系。2.体外培养原代小鼠肾小管上皮细胞(PTECs),在单一的环境下,研究各基因型小鼠肾小管上皮细胞在TGF-betal刺激后,Smad3磷酸化和上皮间质转化(EMT)标记的基因表达水平。明确高血磷,高血活性维生素D3以及高血FGF23在肾脏纤维化中分别的单独作用。3.通过饲育特殊饮食扭转kl/kl小鼠表型后检测正常体液内环境下,UUO施术诱导的RTF是否发生改变研究方法：1.实验动物：klotho基因沉默杂合子(kl/+)小鼠购买自日本CLEA公司,kl/+交配后获得子代kl/kl小鼠和野生型小鼠。各组小鼠普通喂养,标准光照及采食。2. 肾脏纤维化模型：单侧输尿管结扎或者对照组3天或者7天后,处死小鼠,摘取结扎肾脏或者对照肾脏,分为三等分,分别提取蛋白质,mRNA或者福尔马林固定,制作石蜡切片。3. 原代近曲小管上皮细胞培养：使不同基因型肾脏上皮细胞处于同样的培养环境,排出kl/kl小鼠内环境紊乱对实验结果的干扰4. 大鼠永生化肾脏上皮细胞系NRK52E按培养条件要求进行培养5. TGF-β 1刺激诱导EMT实验：上述两种细胞,标准培养条件下,无血清饥饿12小时后,培养基中加入外源性TGF-p 1培养12或者24小时。收集细胞检测EMT指标的表达情况。6. 内环境紊乱体外模拟实验：NRK52E细胞分别在含有2mM,4mM NaH2PO4,外源性FGF23和外源性的活性维生素D3的DMEM培养基内进行培养,以分别模拟体内高血磷,高血FGF23和高血活性维生素D3状态。7. 免疫组织化学或者免疫荧光染色检测UUO术后及对照组肾脏纤维化标记αSMA、Collagen I的表达及分布和Smad3磷酸化情况。8.实时荧光定量PCR检测肾组织a SMA、Collagen I的mRNA水平和体外培养细胞内EMT相关基因(a SMA、Collagen I和E-cadherin)的mRNA水平。9. Western Blot方法检测TGF-betal诱导EMT相关蛋白水平和组织、细胞内Smad3磷酸化水平。10. ELISA方法检测肾脏组织内UUO施术前后TGF-β 1的蛋白质含量。11.收集血清,检测活性维生素D3的含量。12.对于同周龄各组基因型小鼠测量体重。13.内环境紊乱挽救实验：kl/kl小鼠分别饲育正常饲料和不含维生素D3的特制饲料,观察检测其表型变化以及UUO术后肾脏纤维化标记的表达水平。14.采用SPSS 13.0统计分析软件进行Student’s t-test检验和one-way ANOVA with a Student-Newman-Keuls test检验。结果：1、UUO术后各基因型小鼠呈现不同的RTF水平普通饮食6周龄的各基因型小鼠施UUO手术或者假手术作为对照。取术后3天和7天标本,针对RTF指标a SMA、Collagen I进行免疫组织化学染色和qPCR检测。相较于野生型小鼠,kl/+小鼠a SMA、Collagen I表达明显上调(P<0.05)；然而kl/kl小鼠a SMA、Collagen I染色并没有因为klotho蛋白的完全缺失表现出明显上调,相反的,相较于kl/+小鼠a SMA、CollagenI的表达明显下调了。在对照组中,WT和kl/+小鼠a SMA、Collagen I染色几乎是阴性,并且没有差异,而在kl/kl小鼠中a SMA、Collagen I染色明显阳性(P<0.05)。2、kl/kl小鼠结扎肾脏中TGF-β/Smad3信号通路被抑制了我们在检测了各基因型小鼠结扎肾脏和假手术肾脏TGF-β/Smad3信号通路被激活情况。同RTF表现相一致,kl/+小鼠结扎肾脏中磷酸化Smad3 (pSmad3)的阳性染色和组织内蛋白含量均明显升高,TGF-β1的蛋白和mRNA含量也明显升高。kl/kl小鼠结扎肾脏中TGF-β1和pSmad3均被抑制了。而在对照组中,kl/kl小鼠pSmad3阳性染色明显上调,可是TGF-β1的蛋白含量却维持在一个较低的水平上。3、体外原代培养的kl/kl肾小管上皮细胞,TGF-β1诱导的EMT并没有被抑制各基因型小鼠来源的肾小管上皮细胞进行原代培养发现,培养基中加入外源性TGF-β1诱导EMT。与UUO不同,kl/kl细胞EMT指标(a SMA、Collagen I和E-cadherin)和pSmad3并没有被抑制。相较于wt细胞,kl/kl细胞核kl/+细胞EMT指标均上调了,并且二者间没有差异(P>0.05)。结果提示kl/kl小鼠UUO后RTF指标的上调失败和TGF-β/Smad3信号通路抑制是紊乱的内环境导致的而不是由于Klotho蛋白的完全缺失导致的。4、TGF-β1诱导的EMT可以被1,25(OH)2 vitamin D3抑制NRK52E细胞分别在含有高磷酸盐(2mM,4mM),高FGF23 (0.2 μg/ml,2 μg/ml)或者高1,25(OH)2 vitamin D3 (0.1 μg/ml,1μg/ml)的培养基中进行培养。添加外源性TGF-β1到上述培养基后,观测EMT指标变化和Smad3激活情况。只有高1,25(OH)2 vitamin D3剂量依赖性的抑制了TGF-β1诱导的EMT和Smad3激活。高磷酸盐和高FGF23没有产生任何影响。NRK52E细胞单独培养在高膦酸盐的培养基中,即使不加入TGF-β1也表现出一定程度的Smad3激活和EMT相关基因上调。5、无维生素D饲料能够挽救kl/kl小鼠表型,恢复UUO诱导的RTF相关基因的表达我们将kl/kl小鼠饲育无维生素D饲料,发现特殊饮食的kl/kl小鼠在表型上同野生型和kl/+没有区别。体重和血清活性维生素D3水平都恢复到正常。比较普通饮食和特殊饮食的kl/kl小鼠UUO施术后RTF水平和TGF-β/Smad3信号通路激活水平发现特殊饲料组小鼠二者均显著上调了。结论：1、kl/kl小鼠UUO后,RTF和TGF-β/Smad3信号通路被严重抑制；2、RTF和TGF-β/Smad3信号通路被抑制是紊乱的内环境特别是升高的活性维生素D3导致的；3、表型被挽救后,kl/kl小鼠RTF和TGF-β/Smad3信号通路被激活。