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目的:大血管并发症是2型糖尿病患者致残致死的主要因为,其发病机制尚未完全阐明,治疗措施有限。目前认为2型糖尿病大血管病变的病理基础是动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS),它不仅是脂质代谢紊乱的结果,其炎症反应在2型糖尿病内皮损伤和血管中膜病变的发生发展中也起着关键作用。调节炎症反应的核心因子是核因子-κB(Nuclear factor-kappa B,NF-κB)。高血糖、糖基化终末期产物、高血脂等均可激活NF-κB,NF-κB活化后诱导众多因子的转录,包括细胞生长因子、趋化因子、黏附分子和NF-κB抑制蛋白(Inhibitory kappa B,IκB)等,其中许多因子可增强循环中单核细胞的作用,使外周血循环中的单核细胞在血管内皮下聚集和滞留,参与AS早期步骤,也是糖尿病大血管病变发生的重要机制之一。最近研究显示表观遗传相关的组蛋白甲基化酶(histone methyltransferases,HMTs)和组蛋白去甲基化酶(Histone demethylases,HDMs)对NF-κB调节起重要作用,同时也可能参与了糖尿病代谢记忆。表观遗传学是指在基因的DNA序列不发生改变的情况下,基因表达水平与功能发生的改变,它包括DNA甲基化、组蛋白甲基化、乙酰化等共价修饰。应用表观遗传学对疾病发病机制探讨是近年来的研究热点,但在2型糖尿病患者体内HMTs和HDMs与大血管病变的研究尚未见文献报道。故本研究通过检测并比较正常人、2型糖尿病无大血管病变患者和2型糖尿病并发大血管病变患者的组蛋白甲基化酶SET7／9和组蛋白去甲基化酶LSD1(Lysine-specific histone demethylase1)的蛋白表达和mRNA水平以及各组中NF-κB的mRNA表达水平,从而探讨SET7／9和LSD1在2型糖尿病大血管病变中的作用,为进一步治疗糖尿病大血管病变提供理论依据。
方法:1、研究对象分组:(1)健康对照组(NC组):纳入10名健康志愿者；(2)2型糖尿病无大血管病变组(DM组):随机选择2型糖尿病无大血管病变的患者10例；(3)2型糖尿病大血管病变组(DV组):随机选择2型糖尿病并大血管并发症患者10例。2、抽取外周血3.5ml,3ml用于分离出单个核细胞,0.25ml提取总RNA。3、蛋白免疫印迹(Western-blot):检测各组外周血单个核细胞SET7／9及LSD1蛋白表达。4、细胞免疫荧光:细胞涂片,用共聚焦显微镜观察各组中LSD1蛋白表达。5、反转录酶聚合酶链式反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR):检测各组血液中NF-κB、SET7／9及LSD1蛋白mRNA表达。6、统计学处理:应用SPSS17.0统计软件分析数据,数据均以均数±标准差((x)±s)表示,各组间比较用单因素方差分析,两两比较采用q检验,组内比较采用独立样本均数t检验,检验水准α=0.05,P<0.05表示有统计学意义。
结果:1、蛋白表达:(1)SET7／9蛋白表达:与NC组相比,DM组SET7／9蛋白表达变化无统计学意义,但DV组明显升高(P<0.05),较NC组和DM组均增高,其差异有统计学意义(P<0.05)；(2)LSD1蛋白表达:与NC组相比较,DM组和DV组LSD1蛋白表达均降低(P<0.05)；而DV组较DM组降低,差异有统计学意义(P<0.05)。2、免疫荧光:在共聚焦显微镜下观察到NC组外周血单个核细胞LSD1免疫荧光强度最强,DM组较NC组荧光强度有所降低,DV组荧光最弱。3、mRNA表达:(1)SET7／9mRNA表达:与NC组相比,DM组和DV组均升高(P<0.05)；且DV组较DM增高,差异有统计学意义(P<0.05)；(2)各组中LSD1 mRNA表达:与NC组相比,DM组和DV组均降低(P<0.05)；而DV组较DM组降低,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)各组中NF-κB mRNA表达:与NC组相比,DM组和DV组均升高(P<0.05)；且DV组较DM组增高,差异有统计学意义(P<0.05)。
结论:1、糖尿病患者体内存在组蛋白甲基化酶SET7／9和组蛋白去甲基化酶LSD1表达失调。2、SET7／9和LSD1表达失调进而激活炎症基因NF-κB可能是糖尿病大血管并发症发生发展的重要表观遗传机制。