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前言 WNK激酶是一个新的蛋白激酶家族，是With no lysine kinase的缩写。该激酶家族成员在通常保守的位于激酶区域第二亚区的赖氨酸位点，赖氨酸被半胱氨酸所替代，但激酶的生物活性没有发生变化。而其它蛋白激酶此位点的改变通常会丧失激酶生物活性。高表达WNK激酶家族的一个成员——WNK1在HEK293细胞中，没有检测到已知的作用底物生物活性的变化，说明WNK激酶属于一个新的信号传导通路。 大鼠的WNK1基因是这个家族中第一个被克隆的基因。2001年，Wilson等克隆了此家族的另两个成员——人的WNK1和WNK4基因，分别位于12号和17号染色体，这两个基因是一种孟德尔遗传型高血压病的致病基因，致病突变分别是WNK1基因第一内含子的大片段缺失，导致患者白细胞的基因表达量提高5倍左右。WNK4基因突变是位于coiled-coil区域附近一段高度保守区域的错义突变。Northern印迹杂交表明WNK1广泛表达在人类、大鼠和小鼠的各个组织中，有两个转录子。而WNK4则主要在肾脏中表达。 Ⅱ型假性低醛固酮血症(pseudohypoaldosteronism type Ⅱ，PHAⅡ，OMIM #145260)，也被称为Gordon综合症。它以高血压，高血钾和代谢性酸中毒为主要临床表现，它是氯依赖性的，临床异常能够被钠-氯共转子NCCT的特异性拮抗剂——双氢克尿噻纠正，说明此疾病的发生和离子转运相关。 WNK激酶不同于其它蛋白激酶，它们的上游调控子和下游作用底物仍不清楚。免疫荧光表明WNK1激酶位于多种和氯离子内流相关的上皮中，表明它在多种组织中参与氯离子转运的调控。WNK4激酶是紧密复合物的一部分。实验表明野生型WNK4能够抑制NCCT对钠离子的摄入，而WNK1能够抑制这种负调控作用。说明WNK激酶和离子转运通道相作用，调控离子转运，与高血压病的发生相关。 本实验应用克隆、测序、Northern印迹杂交、原位杂交、体外翻译和免疫共沉淀技术，旨在研究WNK基因的表达情况及WNK4激酶的功能。材料与方法 1.材料与试剂 人肾脏组织来源于医院交通创伤患者，小鼠肾脏组织来源于Bal b/c小鼠。pGEM一T载体，感受态细菌JM109，反转录试剂盒和体外翻译试剂盒均购自Promega公司。PcDNA3 .1载体，DH5a感受态细菌及PCR扩增试剂购自Invitrogen公司。Bigdye购自ApPlied Biosystem公司。Northern印迹杂交膜和eo一irrununopreeipitation kit购自Clonteeh公司。同位素购自Am-ersh二和NEN公司。质粒纯化及组织总RNA提取试剂盒购自QIAgen公司。限制性内切酶购自Biolab公司。 2.克隆人WNK4全长cDNA到pGEM一T载体中 提取人肾脏总翻A，用位于WNK4 cDNA第7一27和3808一3833的序列为上下游引物，用long template expanded PCR system扩增WNK4全长eD-NA，产物经纯化后连接到pGEM一T载体，转化感受态细菌，PCR筛查阳性克隆，小量制备阳性质粒，酶切质粒，选取含有正确插人片段的质粒进行测序反应，Navigator 4.0软件分析结果，对序列完全正确的质粒进行大量制备，冻存备用。 3.WNK4基因全长的SNPs检测 设计引物，使PCR产物单一并覆盖基因全长，纯化扩增产物，进行测序反应，用G50纯化产物，于3700型自动测序仪上测序，Navigator 4.0软件分析结果，并进行统计学分析。 4.WNKI基因不同探针的Nori五二印迹杂交 PCR扩增人WNKI基因外显子l，4，5，10一15，以a，转录终止子下游1.6kb一2.2kb片段，纯化产物，同位素标记探针，与人多种组织杂交，洗膜后，曝光在X光片下，洗片并分析结果。 5.原位杂交 以小鼠肾脏总翩A为模板，扩增WNKI基因外显子1，24一28，以a片段和WNK4基因外显子13一16片段，纯化后连接在pGEM一T载体上。筛选阳性克隆，测序，大量制备序列完全正确的质粒。以这些质粒为模板，PCR扩增插人片段，纯化后标记同位素，与小鼠多组织杂交，确定探针特异性。线性化质粒，分别用竹和SP6 RNA多聚酶，掺人3，s一dUTp，体外转录正义和反义探针。检测探针的cPm值。对小鼠肾脏组织切片脱蜡，预杂交，杂交，洗切片，脱水，曝光在X光片下，洗片分析结果，根据信号强弱决定曝光时间。将切片浸人感光乳胶中曝光一定时间，然后洗切片，染色，置于显微镜下观察结果。 6.构建表达载体 .构建带有e一Myc标签的syntenin表达载体.，构建带有HA标签的人WNK4基因coiled一coilZ区域连同附近一个基序的表达载体。用含有限制性酶切位点的上下游引物，以小鼠肾脏总RNA为模板，扩增syntenin基因cDNA，酶切peDNA3 .1载体和扩增产物，纯化酶切产物，T4连接酶连接syn-tenin和载体，转化感受态细菌DHS。，PCR筛查阳性克隆，小量制备阳性质粒，酶切质粒，对结果正确的质粒进行测序反应，分析测序结果，对正确的质粒进行大量制备，冻存备用。以含有wNK4全长。DNA的pGEM一T载体为模板，用含有HA标签及酶切位点的上下游引物进行PCR扩增，酶切peDNA3 .1载体和扩增产物，其它同上。 7.体外翻译蛋白质 用TNT竹eoupled retieuloeyte lysate system kit体外翻译蛋白质，加人l林g的syntenin一e一