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前言 肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension，PAH）是临床常见疾病。大量研究表明：肺血管收缩反应增强和肺血管重构（remodeling）是PAH形成的主要血管变化，人们发现血管重构是肺动脉压持续升高的主要因素，而肺动脉平滑肌细胞（pulmonary artery smooth muscle cells，PASMC）增殖则是血管重构的中心环节。近年来5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）在PAH形成和发展中的作用受到人们的重视。研究表明，它诱导PASMC的增殖与其特异性转载体介导的内在化有关。而且这一作用可被5-HT转载体（5-HT transporter，5-HTT）选择性抑制剂帕罗西汀、氟西汀剂量依赖性抑制。ERK／MAPK（extracellular signal-regulated protein kinase／mitogen-activated protein kinase，ERK／MAPK）信号转导通路与细胞生长分化密切相关，同时在其它类型的血管平滑肌细胞中5-HT诱导的增殖效应与MAPK信号转导通路的关系曾有过报道，但在PASMC中MAPK通路是否参与5-HT的信号转导尚未见报道。但有研究表明，在完整的细胞中，5-HTT介导的5-HT诱导的PASMC增殖与MAPK信号转导通路的激活有关。 为此本实验应用5-HTT选择性抑制剂氟西汀，以明确5-HTT在5-HT促进PASMC增殖过程的作用。并假设5-HTT所介导的PASMC增殖是通过ERK1／2 MAPKs信号转导通路实现的。首次应用针对ERK1／2 MAPK的反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotide，ASODN）抑制PASMC中ERK1／2的表达，使ERK1／2含量下调，观察其对PASMC的增殖情况及细胞周期的影响，以明确5-HTT介导的PASMC增殖与ERK1／2 MAPKs信号转导通路的关系。 方法 采用贴块法分离培养大鼠肺动脉平滑肌细胞。首先应用不同浓度的5-HTT抑制剂氟西汀(10-5M-10-7M)预作用细胞，进行MTT和流式细胞仪检测观察其对5一HT诱导的PASMC增殖情况及细胞周期的影响。应用脂质体介导ERKI/2 ASODN、正义ODN和随机ODN的细胞内转染，同样应用M竹和流式细胞仪方法进行检测，以观察不同类型ODN对5一HT诱导的PASMC增殖情况及细胞周期的影响。实验数据以Mean士SD表示，组间对比采用t检验，P<0.05认为差异显著，P<0.01认为差异非常显著。实验结果 1.氟西汀对5一HT诱导PASMC增殖的作用: 5一HT（20一6皿）显著促进玖sMe增殖。氟西汀（20一，一ro一’M）对5-HT诱导的PASMC增殖有抑制作用，且呈剂量依赖关系，10一SM浓度时抑制作用最强，而在10一7M浓度时则无抑制作用。因此选择10一6M为下一步实验中氟西汀的浓度。10一SM和10一6M浓度的氟西汀与5%FBs组间的细胞存活率无明显差异，说明氟西汀对血清诱导的细胞增殖无抑制作用。 2.ODN对5一HT诱导PASMC增殖的作用: 反义ODN可显著抑制5一HT诱导的PASMC增殖，正义和随机ODN对5一HT诱导的平滑肌细胞增殖无抑制作用。应用反义ODN组与5%FBS组间的细胞存活率存在显著差异。说明ASODN不仅能抑制5一HT诱导的细胞增殖作用，对血清诱导的细胞增殖也有抑制作用。 3.流式细胞仪细胞周期分析: 5一盯（10一6M）组中以sMe的sPF及H值较5%FBs组增加，而应用氟西汀（10一6M）预作用细胞可使两个指标较5一HT（10一6M）组下降。ASODN也可降低5一HT诱导的PASMC的SPF及PI值增加，且其下降幅度较氟西汀组要大。讨论 本实验应用5，HTT选择性抑制剂氟西汀预作用PASMC，可明显抑制5一HT的促细胞增殖效应。进一步证明了5一HTT在5一HT诱导PASMC增殖中的介导作用，也为研究5一H’I’细胞内信号转导提供了方向。同时，本实验首次通过ERKI/2 ASODN转染PASMC，有效地抑制了5一HT诱导的细胞增殖效应，表明ERKI/2 MAPK信号转导通路参与在以SMC中5-HT的信号转导。 近来的研究表明5一HT对PASMC的促增殖作用与低氧条件下细胞中5一H，I’r表达增加有关。而且，应用5一H竹选择性抑制剂及5一H竹基因敲除等方法可抑制低氧诱导的以H，证明5一HTT在PAH形成和发展中起到重要作用。本实验在细胞水平上，应用5一HTT选择性抑制剂氟西汀抑制PASMC在5一HT作用下的增殖反应，再一次证实了5一HTT的介导作用。有助于明确PAH的病理机制，同时也为PAH的治疗提供了新的靶点，应用5一H，IT抑制剂抑制血管平滑肌细胞增殖，可防止肺血管重构的发生。 本实验成功应用脂质体介导ERKI/2 ASODN转染PASMC。并观察到ERKI/2 ASODN能够显著抑制5一HT促细胞增殖，直接证实了ERKI/2MAPK信号转导通路参与5一HT在PASMC的信号转导。研究表明5一HT诱导的PASMC增殖过程中5一HTI’所介导的信号转导通路可能为:GAP酪氨酸磷酸化、RAS激活*NAD（P）H氧化酶激活产生ROS、激活·ERKI/2MAPK。因此应用5一HTT选择性抑制剂即可抑制5一HT诱导的ERKI/2MAPK信号转导通路的激活。 本实验的结果提示，5一HTT介导的5一HT内在化是PASMC发生增殖的重要机制，与PAH时肺血管重构关系密切，是PAH重要发病机制之一。同时，ASODN的应用也为PAH治疗提供了一个新的方案。结论 1.5一HTr选择性抑制剂氟西汀可抑制5一HT诱导的PASMC的增殖，明确了在PASMC中是5一HTr介导5一H