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在碱性或偏碱性土壤上,柑橘极易出现缺铁(Fe)症状,尤其在枳砧上更为明显。目前,关于枳易缺Fe的原因及有关柑橘Fe吸收转运的分子生物学研究较少。前人研究表明IRT1作为一个转运蛋白,在植物根系对Fe的吸收过程中发挥重要作用,其转录表达水平受上游转录因子的调控。本实验室通过对枳PtIRT1的研究发现,其在酵母中表现极强的Fe吸收能力,但其转录表达水平明显低于耐缺Fe的资阳香橙砧木。由此我们推测,虽然枳PtIRT1是一个Fe高效吸收的转运蛋白,但是由于在枳中表达水平总体较低,可能限制了其Fe的吸收效率,导致枳砧柑橘易缺Fe。为证实我们的推测,研究枳PtIRT1表达水平低的原因以及明确是否因此导致枳易出现缺Fe的症状,本课题以枳(不耐缺Fe)和资阳香橙(耐缺Fe)为材料,研究二者IRT1基因及启动子序列和功能差异,鉴定IRT1启动子缺Fe响应的关键序列元件,验证IRT1与上游转录因子FIT的结合。本研究是对前期工作的延续和深入,不仅可以帮助回答生产实践中的科学问题,为柑橘相关领域提供新的理论基础,而且能为最终解决柑橘缺Fe问题奠定基础。本实验以水培枳和资阳香橙的实生苗为材料,克隆了枳和资阳香橙中IRT1基因和转录因子FIT序列,分别将这些基因命名为PtIRT1、CjIRT1、PtFIT和CjFIT,随后分析了这4个基因在不同组织中的以及缺Fe条件下的表达;进行了IRT1启动子遗传转化拟南芥及活性分析;并利用酵母单杂交技术验证转录因子FIT与IRT1启动子的互作。主要研究结果如下:1、枳和资阳香橙IRT1基因及FIT转录因子克隆和序列比较。分别克隆了两种砧木的IRT1和FIT基因ORF全长,枳的基因命名为PtIRT1和PtFIT,资阳香橙的基因命名为CjIRT1和CjFIT。测序结果表明,PtIRT1和CjIRT1的ORF长度均为1061bp,二者核苷酸仅有三个碱基的差异,氨基酸有2个残基存在差异,相似性为99.43%;PtFIT和CjFIT的ORF长度均为941bp,核苷酸有17个碱基的差异,氨基酸有10个碱基存在差异,相似性为96.81%。2、PtIRT1、CjIRT1、PtFIT和CjFIT的表达模式。定量PCR分析表明,在正常培养条件下,PtIRT1、CjIRT1、PtFIT和CjFIT在茎和叶中的表达量极低,在根中的表达量显著较高。在缺Fe条件下,根中PtIRT1、CjIRT1、PtFIT和CjFIT表达量上调明显,在缺Fe处理10 d后,根中CjIRT1和CjFIT上调的幅度显著高于PtIRT1和PtFIT。3、枳和资阳香橙IRT1启动子克隆及序列分析。克隆枳和资阳香橙IRT1基因转录起始位点前约2000bp的启动子片段,得到实际扩增枳PtIRT1启动子的长度为2022bp,资阳香橙CjIRT1启动子长度为1966bp,两者的序列相似性为91.54%。通过分析PlantCARE等网站进行元件预测分析,发现PtIRT1启动子和CjIRT1启动子分别有19个类型的功能元件,包括组成启动子的核心元件和环境响应元件。核心元件有CAAT-box,TATA-box等,环境响应元件包括光响应元件Box 4、Ibox,激素响应元件TATC-box、TCA-element、ABRE等。PtIRT1和CjIRT1启动子中有两个元件存在差异,PtIRT1启动子中差异元件TC-rich repeats和LTR元件分别涉及对胁迫和低温的响应,CjIRT1启动子中差异元件AAAC-motif和GT1-motif元件涉及对光的响应。4、枳和资阳香橙IRT1启动子不同缺失片段活性分析。克隆了枳和资阳香橙IRT1转录起始位点上游长度为1500bp,1000bp,500bp和300bp的启动子片段,将这些片段连接在GUS融合表达载体上,遗传转化拟南芥,经过三代培养,筛选出包含目的片段的纯合子植株,对这些植株正常和缺Fe培养后进行GUS染色,分析启动子不同片段的活性;结果表明在正常培养条件下,转入不同片段的拟南芥幼苗都会有一定程度的染色,其中转入1500bp片段的幼苗全株都会染上蓝色,并且染色程度较深,转入1000bp,500bp和300bp片段的植株会在叶片和根部有少量染色。在缺Fe条件下,转入PtIRT1启动子1500bp、1000bp和CjIRT1启动子1500bp、1000bp、500bp的植株全株染色程度较深,表明缺Fe胁迫对IRT1启动子有一定程度的激活作用。5、酵母单杂交技术验证转录因子FIT与IRT1启动子的互作。构建含转录因子的猎物载体,并将长度为1000bp的PtIRT1、CjIRT1启动子片段连接入诱饵载体,将诱饵载体转入酵母,验证后进行背景表达水平检测,筛选出合适的AbA浓度,随后将猎物载体转入上述酵母,在含有适宜AbA浓度的培养基上进行培养,结果显示转入猎物载体后,酵母能够生长,表明转录因子FIT和PtIRT1、CjIRT1启动子存在相互作用,为后续筛选启动子中与FIT互作的功能元件奠定了基础。