论文部分内容阅读
拉沙病毒(Lassa virus，LASV)属于沙粒病毒科(Arenaviridae)沙粒病毒属(Arenavirus)。到目前为止，已陆续发现30多种沙粒病毒，根据其血清学特性、遗传关系和地理分布，可以将沙粒病毒分为两大类:旧世界沙粒病毒和新世界沙粒病毒。本实验课题的研究对象拉沙病毒属于旧世界沙粒病毒。拉沙病毒的天然宿主是非洲多乳鼠，人通过直接接触其排泄物或暴露于气溶胶中被感染，人际传播则主要通过接触患者血夜、尿液、粪便或其它排泄物等途径。 拉沙病毒感染人体会引发拉沙热(Lassa fever,LF)。拉沙热主要在利比亚、尼日尼亚、塞拉利昂、几内亚等非洲地区流行和传播。此外，世界范围内的其他国家和地区也有输入性感染病例报道。据统计，每年约有30～50万人感染拉沙病毒，住院患者的死亡率为20％～70％。然而，目前还没有FDA批准的可用于治疗或预防拉沙热的药物或疫苗，唯一能在拉沙病毒感染早期起作用的药物利巴韦林会给人体带来严重的副作用。美国CDC将其归类为A级生物恐怖病原，针对该病毒的研究活动必须在生物安全等级为4级的实验室(BSL-4)中才能进行。 拉沙病毒包膜糖蛋白(glycoprotein complex，GPC)是病毒包膜的重要组成部分，GPC上11个糖基化位点通过天冬酰胺连接上11条N-糖链，这11条N-糖链相对均匀地分布在GPC蛋白表面，其中GP1上有7条，GP2上有4条，11条N-糖链的分子量约占GPC蛋白分子总量的25％。糖链参与GPC蛋白的多种生物学功能，如:表达、切割、折叠、受体识别、抗原遮蔽、免疫反应等。通过对感染了拉沙病毒的住院病人进行的相关调查研究发现，只有在少数恢复期病人的较晚阶段才能检测到少量中和抗体的产生，且这些抗体的中和力较低。而在机体对抗拉沙病毒的免疫反应中，发现主要是细胞免疫反应在发挥作用。此外，在艾滋病毒、丙肝病毒、流感病毒、埃博拉病毒等病毒中发现了大量关于糖链遮蔽抗原表位的相关文献报道。我们由此推测在拉沙病毒中，可能是由于包裹在病毒颗粒膜蛋白表面的数量多、分子量大的N-糖链遮蔽了GPC的一些重要抗原表位，从而影响了机体对拉沙病毒的免疫识别，进而抑制了机体对拉沙病毒的特异性免疫反应的诱导，最终导致拉沙热的治疗和康复变得困难。因此，研究清楚拉沙病毒GPC上11个N-糖链在机体免疫应答中的作用，有助于找到拉沙病毒的免疫逃逸机制，从而为后续研发出有效的抗拉沙病毒疫苗或治疗性抗体提供科学依据。 N-糖链修饰通过与Asn-X-Thr/Ser(X为除脯氨酸外的任意氨基酸)多肽链基序中的天冬酰胺相连接，而偶联至拉沙病毒包膜糖蛋白上。在本实验中，我们首先研究了不同突变策略引起的糖链缺失对GPC蛋白结构和功能的影响，最终选择将多肽基序中的天冬酰胺突变为谷酰胺的重组质粒作为DNA免疫疫苗。我们分别用野生型和突变型重组质粒免疫BALB/c小鼠，3次免疫后检测分离得到的脾脏淋巴细胞中免疫细胞和免疫因子的应答情况，同时收集免疫血清检测抗体的滴度和中和能力。发现GPC上第1、3、5、6、8、9、10个N-糖链的缺失能显著增强机体的细胞免疫应答，尤其是Th1型细胞免疫;GPC上第3、5、6、8、9个N-糖链的缺失能显著增强机体的体液免疫应答，可以诱导机体产生滴度更高的抗体。遗憾的是，糖基化位点突变的GPC免疫小鼠得到的血清的抗体中和能力并无显著提高。结合GPC蛋白的结构分析，我们推测第3、5、6、8、9个位点的N-糖链最有可能遮蔽了GPC上的关键抗原表位，与宿主的细胞免疫应答的诱导和体液免疫中抗体的产生有关，可能作为研制出高效的抗拉沙热的治疗性或预防性疫苗的突破点。