论文部分内容阅读
铁元素是生物进行多种代谢活动的重要辅助因子,真菌抵抗氧化胁迫以及提高自身的耐受性都需要铁代谢相关蛋白发挥重要作用。本研究通过同源克隆得到红根病菌铁代谢相关的三个基因,并利用生物信息学技术预测和分析其蛋白功能;使用己唑醇和青蒿琥酯对橡胶树红根病菌进行室内毒力测定,测定其抑菌率及对铁代谢相关蛋白表达情况的影响,为阐明橡胶树红根病菌的耐药性分子机制提供理论基础。利用雷帕霉素、膦甲酸钠、已唑醇及对亚铁螯合酶FECH有靶向抑制作用的灰霉菌素、维罗菲尼等农药协同处理红根病菌,探究农药混剂作用效果。通过室内青蒿琥酯对斑马鱼的胚胎发育毒性效应研究,有助于我们了解其剂量效应及环境相容性,为大田试验等打下基础。结果如下:1.克隆到3个铁代谢相关基因,并分析和预测相关蛋白的理化性质。根据橡胶树红根病菌GP020菌株转录组测序结果,通过NCBI数据库进行比对,利用Primer 5.0设计引物,克隆得到3个铁代谢相关基因,分别命名为:铁通透酶编码基因Gpftr1、多铜氧化酶编码基因Gpfet3、亚铁螯合酶编码基因Gpfech,基因编码区全长分别为1191 bp、1887 bp、1071 bp。利用生物信息学分析方法分别对3个铁代谢相关蛋白进行理化性质分析,其中Gpftr1基因编码396个氨基酸,推测其分子量为43.23 kDa,等电点为6.92,为疏水性蛋白,具有保守基团REXLE和7个跨膜结构域,无信号肽。Gpftr1与紫芝Gsinens 铁通透酶基因(登录号:PIL27756.1)的亲缘关系最近,氨基酸同源性高为89%;Gpfet3基因编码628个氨基酸,推测其分子量为39.21 KDa,等电点为7.73,为亲水性蛋白,1个跨膜结构域,有信号肽。Gpfet3与赤芝G.lu idum多铜氧化酶基因(登录号:AHA83598.1)亲缘关系最近,氨基酸同源性高为96%;Gpfech基因编码356个氨基酸,推测其分子量为68.38 KDa,等电点为5.02,为亲水性蛋白,无跨膜结构域,无信号肽。Gpfech与紫芝G.sinense亚铁螯合酶基因(登录号:PIL34031.1)亲缘关系最近,氨基酸同源性高为96%。2.铁转运蛋白GpFTR1与GpFET3的亚细胞定位检测利用根癌农杆菌介导的烟草瞬时表达方法,将目的基因FTR1和FET3分别连接到植物表达载体pBin-GFP上,构建成重组植物表达载体pBin-GpFTR1-GFP和pBin-GpFET3-GFP,转化农杆菌GV3101并导入本氏烟中,通过激光共聚焦显微镜观察绿色荧光信号定位情况。GpFTR1蛋白的绿色荧光信号定位在细胞膜上。GpFET3蛋白的绿色荧光信号也定位在细胞膜上。3.己唑醇和青蒿琥酯对红根病菌的毒力测定及铁代谢基因的表达检测生长速率法测定己唑醇EC50为0.192 mg/L;青蒿琥酯EC50为26.288 mg/L。本试验用己唑醇和青蒿琥酯两种药剂分别在不同时间、不同浓度处理橡胶树红根病菌,检测铁代谢蛋白基因的表达情况。两种药剂分别以EC50浓度处理红根病菌,在2h、4h、6h、8h、12h、24h、72h的3种铁代谢蛋白的实时荧光定量PCR结果显示,3种蛋白均在在己唑醇处理后6 h表达量最高。3种蛋白均在青蒿琥酯处理后4 h表达量最高。己唑醇不同浓度0.1、0.4、1.6、6.4、25.6 mg/L处理红根病菌,Gpftr1基因总体呈先上调后下调的趋势,在己唑醇浓度为0.1 mg/L时,上调表达最显著为1.21倍;Gpfet3基因均表现为下调;Gpfech基因呈现先下调后上调的趋势,在25.6 mg/L时上调表达最显著为1.81倍。青蒿琥酯不同浓度2.8、8.6、26、78、234 mg/L处理红根病菌,Gpftr1基因呈现先上调后下调的趋势,在浓度为2.8 mg/L时,表达上调显著为1.21倍,Gpfet3基因与Gpfech基因在不同浓度下均下调。4.几种药剂混用对红根病菌的联合作用试验采用垂直滤纸法分别对己唑醇与灰黄霉素、己唑醇与雷帕霉素、己唑醇与膦甲酸钠混剂对橡胶树红根病菌进行抑菌试验,根据对抑菌带的分析,己唑醇与其他药剂的混剂均具有相加作用。单剂仍然是己唑醇效果最好,抑菌带达3.5 mm。5.青蒿琥酯原药对斑马鱼胚胎的急性毒性试验青蒿琥酯有一定抑制红根病菌能力,为大田试验时,提供其对环境相容性数据,按照OECD标准,检测青蒿琥酯原药对斑马鱼胚胎的急性毒性,设置五个浓度分别为 31 mg/L、42 mg/L、56 mg/L、75 mg/L、100 mg/L。随浓度升高,毒性越来越大。24 h时青蒿琥酯对斑马鱼胚胎暂无影响,48 h斑马鱼开始出现卵黄囊肿和心包囊肿,96 h急性致死浓度LC50为9.435 mg/L,对斑马鱼心脏毒性有一定影响,属于中毒。