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传染性支气管炎(Infectious Bronchitis，IB)是禽类的一种呼吸道疾病，具有急性、高度接触传染性的特征，由传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus，IBV)引发。IB在免疫和非免疫家禽之间爆发和传染的根本原因在于IBV容易突变，不同的血清型之间的交叉保护性很弱或者没有。IB是危害世界养禽业的重要疫病之一。M蛋白是具有重要免疫功能的结构蛋白，可诱导强烈的细胞免疫应答。因此，制备针对IBVM蛋白的单克隆抗体，为IBV抗原表位的鉴定及抗原快速检测方法的建立等提供有力的工具。
本研究将IBVM41毒株通过接种鸡胚的方法扩繁，从含病毒的尿囊液中提取总RNA，RT-PCR扩增M基因，构建原核表达载体pGEX-6p-1并导入大肠杆菌Transetta(DE3)内诱导表达。SDS-PAGE分析其产物显示约41kD左右的分子量，主要是包涵体。对重组M蛋白梯度尿素进行变性，逐步透析进行复性，Westernblot显示，重组M蛋白能与阳性鸡血清特异性反应，表明重组M蛋白具有良好的反应原性。
免疫原是复性后的重组M蛋白，免疫动物为BALB/c小鼠，进行皮下多点免疫。超强免疫后，选取血清效价高的小鼠，取其脾淋巴细胞与小鼠SP2/0细胞融合。分别用重组M蛋白和GST蛋白作为包被原，SP2/0细胞上清液为阴性对照，采用间接ELISA筛选阳性孔。亚克隆3~4次后，获得11株稳定分泌抗IBVM蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。选取效价最高的9C11杂交瘤细胞株接种小鼠，通过小鼠体内诱生腹水的方法大量制备抗M蛋白的单克隆抗体，辛酸/硫酸铵方法对腹水进行纯化，并且对纯化的单抗进行鉴定。SDS-PAGE显示，纯化后的抗体具有较高的纯度。纯化后的抗体效价为5.12×105，亲和常数Ka为6.49×108L/mol。Westernblot表明9C11单抗能与重组M蛋白发生特异性反应。免疫过氧化物酶单层细胞实验(IPMA)显示，抗M蛋白9C11单抗能与IBVM41结合。
本研究成功制备了抗IBVM蛋白单克隆抗体，并且可以和IBVM41结合，对IBV检测及M蛋白功能的研究具有重要意义。
本研究将IBVM41毒株通过接种鸡胚的方法扩繁，从含病毒的尿囊液中提取总RNA，RT-PCR扩增M基因，构建原核表达载体pGEX-6p-1并导入大肠杆菌Transetta(DE3)内诱导表达。SDS-PAGE分析其产物显示约41kD左右的分子量，主要是包涵体。对重组M蛋白梯度尿素进行变性，逐步透析进行复性，Westernblot显示，重组M蛋白能与阳性鸡血清特异性反应，表明重组M蛋白具有良好的反应原性。
免疫原是复性后的重组M蛋白，免疫动物为BALB/c小鼠，进行皮下多点免疫。超强免疫后，选取血清效价高的小鼠，取其脾淋巴细胞与小鼠SP2/0细胞融合。分别用重组M蛋白和GST蛋白作为包被原，SP2/0细胞上清液为阴性对照，采用间接ELISA筛选阳性孔。亚克隆3~4次后，获得11株稳定分泌抗IBVM蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。选取效价最高的9C11杂交瘤细胞株接种小鼠，通过小鼠体内诱生腹水的方法大量制备抗M蛋白的单克隆抗体，辛酸/硫酸铵方法对腹水进行纯化，并且对纯化的单抗进行鉴定。SDS-PAGE显示，纯化后的抗体具有较高的纯度。纯化后的抗体效价为5.12×105，亲和常数Ka为6.49×108L/mol。Westernblot表明9C11单抗能与重组M蛋白发生特异性反应。免疫过氧化物酶单层细胞实验(IPMA)显示，抗M蛋白9C11单抗能与IBVM41结合。
本研究成功制备了抗IBVM蛋白单克隆抗体，并且可以和IBVM41结合，对IBV检测及M蛋白功能的研究具有重要意义。