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第一部分白头翁皂苷B4缓解顺铂所致的急性肾损伤目的:顺铂作为一种高效化疗药物,通常用于治疗多种恶性肿瘤。然而由于顺铂本身存在严重的毒副作用,尤其是肾毒性,使其临床应用受到严格的限制。白头翁为毛莨科植物白头翁的干燥根,主要有效成分为皂苷类化合物,其中白头翁皂苷B4为其中的指标性成分。已有文献报道白头翁皂苷B4在体外具有一定的抗炎作用,但目前尚无有关于白头翁皂苷B4对于顺铂诱导的肾损伤是否具有治疗作用的研究。本研究中,我们建立了顺铂诱导的肾细胞损伤的体外和小鼠模型,并评价了白头翁皂苷B4对于该损伤的预防效果,并初步阐明了其作用机制。方法:体内建立顺铂诱导Balb/c小鼠肾功能衰竭模型,通过观察小鼠生存状态、生化检测以及病理切片染色考察白头翁皂苷B4对于肾脏的保护作用;建立顺铂诱导的体外肾细胞损伤模型,采用CCK-8试剂盒测定白头翁皂苷B4对肾细胞活力的影响;光学显微镜观察细胞形态;通过蛋白质免疫印迹法半定量考察肾脏组织及细胞内蛋白表达的变化,包括凋亡相关蛋白p53、Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase 3,MAPK家族成员ERK、JNK、p38,炎症相关蛋白p65、COX-2、IL-1β;采用化学试剂盒评估细胞内抗氧化能力,包括还原型谷胱甘肽(GSH)、过氧化氢酶(CAT)以及超氧化物歧化酶(SOD);流式细胞术检测白头翁皂苷B4对于细胞内活性氧(ROS)的影响。结果:顺铂(20 mg/kg)单次腹腔注射4天后诱导小鼠形成严重的急性肾损伤,与正常对照组相比,小鼠体重大幅度下降(P<0.001),肾脏指数明显上升(P<0.05),血清肌酐(creatinine,P<0.05)、血尿素氮(blood urea nitrogen,P<0.01)水平显著升高,肾组织HE染色显示小鼠肾小管水肿及大量炎性浸润;相较于模型组,提前3天腹腔注射白头翁皂苷B4(100 mg/kg,bid)小鼠体重下降趋势明显减缓(P<0.05),肾脏指数及血清中肌酐、尿素氮含量显著下降(P<0.05),肾脏水肿及炎性浸润亦得到改善。与对照组相比,顺铂(20μM)刺激人胚肾细胞(HEK-293T)24 h后细胞存活率明显下降(P<0.001),观察细胞形态发现细胞皱缩、结构损坏;而白头翁皂苷B4(12μM)预处理1 h后肾细胞存活率显著提高(P<0.001)。在体内外顺铂致肾毒性模型中,凋亡蛋白Bax、p53、Cleaved-caspase 3表达显著上调(P<0.05),Bcl-2显著下调(P<0.05),而炎症相关蛋白COX-2、IL-1β、RAGE、S100A9表达均显著上调(P<0.05);白头翁皂苷B4可以有效地抑制凋亡蛋白Bax/Bcl-2、p53、Cleaved-caspase 3以及炎症相关蛋白COX-2、IL-1β、RAGE、S100A9的表达(P<0.05)。同时顺铂导致HEK-293T细胞中MAPKs家族成员p-JNK(P<0.01)、p-p38(P<0.05)、p-ERK(P<0.05)以及NF-κB通路的p-p65(P<0.05)蛋白表达显著上调,活性氧释放增加(P<0.01),CAT、SOD酶活性下降(P<0.01),GSH含量减少(P<0.05);而白头翁皂苷B4(12μM)预处理1 h后,明显抑制细胞内p-JNK、p-p38、p-ERK的蛋白表达(P<0.05),ROS释放减少(P<0.05),抗氧化酶活性(P<0.01)及GSH水平(P<0.05)增加。这些结果提示白头翁皂苷B4体内外均能够抑制顺铂诱导的急性肾损伤。第二部分白头翁皂苷B4缓解链脲佐菌素所致的糖尿病肾病目的:糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病,目前我国糖尿病患病人数超过1亿,已经成为严重威胁人类健康的世界性公共卫生问题。而糖尿病肾病作为糖尿病最常见的微血管并发症,在Ⅰ型糖尿病患者中肾病发生率达40%～50%,Ⅱ型糖尿病患者中约30%,其发病机制十分复杂,高糖、炎症、氧化应激均参与了糖尿病肾病的发生和发展。前面我们已发现白头翁皂苷B4抑制急性肾损伤,因此本研究中,我们建立了糖尿病大鼠和高糖诱导系膜细胞增殖模型,考察白头翁皂苷B4对于糖尿病肾病的治疗效果,初步阐明其作用机制。方法:建立链脲佐菌素(STZ)诱导SD大鼠糖尿病肾病模型,通过观察大鼠生存状态、饮食情况、病理切片染色以及足细胞凋亡,检测糖脂代谢及血清生化指标,考察白头翁皂苷B4对于糖尿病并发症的治疗作用;酶联免疫吸附法(ELISA)检测肾脏组织中细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的含量变化;采用CCK-8试剂盒测定白头翁皂苷B4对系膜细胞增殖的影响;流式细胞仪检测白头翁皂苷B4对于系膜细胞内活性氧(ROS)的影响;相关化学试剂盒评估细胞内抗氧化能力,包括还原型谷胱甘肽(GSH)、过氧化氢酶(CAT);通过蛋白质免疫印迹法测量肾脏组织及细胞内JNK、p38、p65蛋白表达的变化。结果:链脲佐菌素(55 mg/kg)单次腹腔注射7天后诱导大鼠血糖≧16.7 mmol/L,即糖尿病模型成立,大鼠体重增长趋势明显减缓(P<0.001),多饮、多食(P<0.001),血糖急剧增加(P<0.001),试剂盒检测发现尿中出现尿蛋白(P<0.05)、肾脏指数(P<0.001)、肝脏指数(P<0.01)明显上升;血清中甘油三酯(TG,P<0.05)、胆固醇(TC,P<0.05)、谷丙转氨酶(ALT,P<0.05)以及尿素氮(BUN,P<0.01)含量显著升高;肾组织病理切片PAS染色显示大鼠肾小球(P<0.01)及糖原(P<0.001)面积增加,肾小球系膜扩张,Masson染色显示肾小管间质纤维化,胶原纤维增加(P<0.05),肾脏组织中炎症因子IL-1β(P<0.05)、IL-6(P<0.001)、TNF-α(P<0.001)大量分泌,足细胞尚未明显凋亡,同时有66.67%的糖尿病大鼠出现白内障眼;与模型组相比,腹腔注射白头翁皂苷B4(5 mg/kg,bid)8周后,大鼠体重增长趋势明显加快(P<0.05),饮水减少(P<0.05),血糖下降(P<0.01),肾脏指数(P<0.01)、肝脏指数(P<0.05)、血清中TG(P<0.05)、TC(P<0.001)、BUN(P<0.05)均显著下降,肾组织病理切片显示糖原(P<0.01)及胶原纤维(P<0.05)减少,炎症因子IL-1β(P<0.05)、IL-6(P<0.001)、TNF-α(P<0.05)的释放受到抑制,白内障眼的发生率下降至31.25%。在体外实验中,高糖(25 m M)刺激小鼠肾小球系膜细胞(SV40 MES13)24 h后细胞迅速增殖(P<0.01),活性氧大量释放(P<0.01);而白头翁皂苷B4(50、100μM)预处理后,系膜细胞增殖明显抑制(P<0.05),ROS释放减少(P<0.01),CAT酶活性(P<0.01)及GSH水平(P<0.05)提高。在体内外高血糖模型中,MAPKs家族成员p-JNK(P<0.01)、p-p38(P<0.05)以及NF-κB通路的p-p65(P<0.05)蛋白表达显著上调;而白头翁皂苷B4明显抑制细胞内p-JNK、p-p38、p-p65以及组织中p-p38、p-p65的蛋白表达(P<0.05)。以上结果提示白头翁皂苷B4能够缓解链脲佐菌素引起的糖尿病肾病。结论:白头翁皂苷B4能够明显抑制顺铂诱导的急性肾损伤,缓解糖尿病肾病,体外也具有抑制肾细胞凋亡和系膜细胞增殖的作用,机制研究表明可能与其抑制凋亡相关蛋白的表达、炎症因子释放以及MAPKs信号通路、NF-κB信号通路的激活,同时抑制氧化应激,提高抗氧化酶活性有关,本研究为白头翁皂苷B4治疗肾病的药物研发研究提供了实验基础。