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1.用于荧光定量PCR的内参基因的选择与评估 棉铃虫Helicoverpa armigera是世界性害虫，严重危害各种蔬菜和农作物。由于其寄主多样、能够迁飞、世代重叠、繁殖力强，以及对大部分杀虫剂具有抗性等生物学特点，使棉铃虫的田间防治面临巨大的挑战。从分子水平了解重要调控基因的功能是害虫防治的基础。在棉铃虫的研究中，筛选稳定表达的内参基因是利用qRT-PCR技术研究基因的表达水平的基础。然而目前尚无关于棉铃虫内参基因筛选及稳定性评估的研究报道。本研究利用Delta Ct，Norm Finder，BestKeeper和geNorm四种评估方法及软件，系统分析了荧光定量PCR实验中棉铃虫9个候选内参基因: beta-tubulin(TUBB)、TATAbinding protein(TBP)、 ribosomal protein S15(RPS15)、 heat shock protein90(HSP90)、glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)、ribosomal protein L28(RPL28)、arginine kinase(AK)、glutathione S-transferase(GST)和beta-actin(ACTB)在不同实验处理条件下（不同温度处理、机械损伤处理、饥饿处理、不同光周期以及不同发育阶段）的表达稳定性情况。并采用一个综合分析在线软件RefFinder将四中评估的结果统一，得到相应处理条件下的最佳候选内参基因。经过研究评估发现:RPL28和RPS15是在饥饿处理、温度压力、及不同发育阶段下的最稳定表达的内参基因;HSP90和TUBB在不同光周期条件下表达稳定;TUBB和GAPDH为机械损伤处理下的稳定表达内参基因。此结果为qRT-PCR标准化试验提供必要支持。 2.丝氨酸蛋白酶抑制基因的分子克隆及表达分析 丝氨酸蛋白酶抑制剂基因在蛋白酶抑制剂超家族中分布及其广泛。目前，在动动物、昆虫及细菌中，均有对这一类基因的报道。包括自身免疫系统、生长发育、细胞凋亡过程、纤维蛋白溶解以及血液凝固等关键生物过程在内，蛋白酶抑制剂基因具有所参与。本研究中，我们成功克隆了棉铃虫三个蛋白酶抑制剂基因(Haserpin、HaTIL1和HaTIL2)。经测定分析Haserpin、HaTIL1和HaTIL2的cDNA的全长为分别为1382、980和470bp，开放阅读框大小分别为1134、864和240bp，编码氨基酸个数分别为41.916、32.428和8.632 kDa，对应氨基酸序序列的理论等电点分别为4.98、4.89和4.41。经过多重比对分析发现:克隆的Haserpin基因与蓓带夜蛾Mamestra configurata和甘蓝夜蛾Mamestra brassicae的Haserpin基因的相似度达到65％，与其他昆虫serpin基因的相识度在51-59％之间;克隆的HaTIL2基因与小蜜蜂Apis florea的HaTIL2基因的相似度为36％，与其他昆虫HaTIL2基因的相似度在31-34％之间。基因结果分析发现:Haserpin和HaTIL1没有内含子;而HaTIL2基因有一个338 bp的内含子。利用荧光定量PCR分析三个基因的表达情况，发现三个基因再棉铃虫发育过程中，主要在脂肪体中表达。