论文部分内容阅读
目的：本研究通过体外培养人肾小球内皮细胞（HGECs)，筛选血管紧张素Ⅱ（Ang II）对HGECs合适的作用浓度与时间，探讨血管紧张素1-7（Ang1-7）对HGECs的作用及可能机制。 方法 1方法1.HGECs的培养：细胞在含15%胎牛血清的低糖DMEM中于培养箱（饱和湿度、37℃、5%CO2）中常规培养。每24h进行更换新的培养液一次。HGECs汇合度约70%-80%左右后，用0.25%EDTA的胰蛋白酶进行消化、传代。2实验分组：所有细胞组在实验前更换无血清培养基静止培养12h，根据不同的干预因素将细胞随机分为6组：对照组（control组，不加干预因素组）、血管紧张素Ⅱ组（只加入AngⅡ）、血管紧张素1-7组（只加Ang1-7）、血管紧张素Ⅱ+血管紧张Ang1-7组（Ang II+Ang1-7组，先用Ang1-7预处理30min，再加入Ang II干预）、血管紧张素Ⅱ+血管紧张Ang1-7+Mas受体阻断剂组（AngⅡ+Ang1-7+A779组，先加A779预处理15min后再加Ang1-7干预30min，最后加入AngⅡ处理）、Mas受体阻断剂组（A779组）。3利用CCK-8实验检测细胞的毒性与测定细胞活力，依据加药后不同的细胞活力来筛选药物AngⅡ、Ang1-7、A779的作用浓度，选择合适的作用浓度与时间。4采用流式细胞学技术比较各组HGECs的凋亡率；利用流式仪检测DCFH-DA荧光标记的各组细胞内总体活性氧簇（ROS）含量，荧光显微镜照相法拍摄各组细胞ROS；5利用微板法技术测定HGECs培养液中乳酸脱氢酶（LDH）的漏出量；应用硝酸还原酶法，间接测定HGECs培养液中一氧化氮（NO）释放水平；通过酶联免疫吸附（ELISA）实验检测HGECs的培养液中白介素-6（IL-6),肿瘤坏死因子α（TNF-?)，转化生长因子β1（TGF-?1)，单核趋化蛋白-1（MCP-1)，细胞间黏附分子-1（sICAM-1），内皮素（ET-1)的含量。 结果 1通过CCK-8细胞增殖实验，其中以HGECs活力较对照组的细胞活力具有显著的统计学差异作为最适浓度，选取1?mol/L的Ang II作用24 h作为干预浓度及时间，而Ang1-7在Ang II的基础上、A779在Ang II+Ang1-7的存在下测定各浓度梯度细胞活力变化，其中以出现显著差异浓度组为最佳。分别选取Ang1-7为0.1?mol/L、A779为10?mol/L。2与对照组比较，AngⅡ（1?mol/L）组中的HGECs凋亡率、胞内ROS（平均荧光强度）增加（P＜0.05），上清液中IL-6、TNF-α、TGF-β、MCP-1、sICAM-1的含量增加（P＜0.05）；与AngⅡ（1.0?mol/L）组比较，AngII+Ang1-7（1.0+0.1?mol/L）组的细胞凋亡率、ROS水平降低，IL-6、TNF-α、TGF-β1、MCP-1、sICAM-1的含量减少（P＜0.05）；与AngⅡ+Ang1-7（1+0.1?mol/L）组比较，A779（10?mol/L）的加入增加了细胞的凋亡率、胞内ROS的含量，IL-6、TNF-α、TGF-β1、MCP-1、sICAM-1含量增多（P＜0.05）。3在AngⅡ（1?mol/L）的基础上比较，Ang1-7（10、1、0.1、0.01μmol/L）的加入呈剂量依赖性抑制了LDH漏出、ET-1分泌、促进NO的释放（P＜0.05）。 结论 1.AngⅡ可使HGECs凋亡率增加、ROS生成增多、炎症因子表达增多。2.Ang1-7通过Mas受体可降低AngⅡ致HGECs的凋亡率、减少ROS生成和炎症因子表达；3.在AngⅡ的存在下，Ang1-7的加入呈浓度依赖性抑制AngⅡ所致HGECs的损伤作用，其中LDH的漏出和ET-1的分泌减少、NO释放增多，而其保护作用可被Ang1-7拮抗剂A779几乎完全取消。