人端粒酶催化亚单位基因的表达及其多克隆抗体的制备

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  人端粒酶催化亚单位是人端粒酶各组分中唯一在肿瘤组织中表达而在正常组织中不表达的亚基。鉴于端粒酶的激活和肿瘤密切相关,而hTERT基因的表达又是端粒酶激活系列反应中的限速步骤,因此hTERT基因的表达可以作为肿瘤的平行标志而应用于肿瘤的检测和诊断。   本文借助分子生物学软件列出hTERT上9mer肽段与HLA-A2.1分子分离的半数时间,该时间越长则意味着该肽段在抗原、HLA和细胞毒性T细胞三者的相互作用中意义越大。据此选取了半数时间最长的540ILAKFLHWL548、555ELLRSFFYV5632个肽段作为主要肿瘤相关抗原。通过PCR扩增了含有以上肽段编码序列的一段hTERT基因,尝试在毕赤酵母和大肠杆菌中进行重组表达,并在大肠杆菌中获得了成功表达。在大肠杆菌表达系统中,将hTERT基因克隆至表达载体pGEX-4T-1中,构建了重组表达质粒pGEX-hTERT,转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,并筛选出稳定表达的工程菌。超声后SDS-PAGE分析,表达产物以包涵体形式存在。包涵体经洗涤、变性和SDS-PAGE纯化后,作为抗原免疫小鼠,制备得到较高效价的免疫血清。在去除了交叉反应抗体之后,该血清显示了良好的特异性,可作为进一步研究hTERT基因表达的辅助材料。用此免疫血清通过Westernblot免疫印迹法检测了人急性单核细胞性白血病细胞株THP-1中hTERT基因的表达,结果呈阳性,并通过RT-PCR法检测hTERT在mRNA水平上的表达验证了此结果。
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