【摘 要】
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为了建立高效稳定的动物转基因技术平台，本论文探索了卵胞浆内单精子注射法(IntracytoplasmicSpermInjection，ICSI)生产转基因绵羊的可行性。主要研究内容及结果如下：1.首先，利用
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为了建立高效稳定的动物转基因技术平台，本论文探索了卵胞浆内单精子注射法(IntracytoplasmicSpermInjection，ICSI)生产转基因绵羊的可行性。主要研究内容及结果如下：1.首先，利用扫描电镜和激光共聚焦显微镜对绵羊冻融精子与DNA的结合情况进行了观察和确认。实验表明，绵羊冻融精子可以有效的结合外源DNA。
2.比较了Piezo注射法与常规注射法对ICSI转基因效率的影响。实验结果显示，Piezo注射法ICSI胚胎的阳性率平均达到79.1％，而常规注射法ICSI胚胎的阳性率仅为9.0％。
3.探讨了两种不同的激活方法对ICSI卵子发育的影响。结果显示，离子霉素(Ionomycin)与放线菌酮(CHX)联合激活组ICSI卵子的卵裂率高于离子霉素(Ionomycin)单独处理组(85.1％vs59.8％，P＜0.01)。
4.比较了三种不同浓度DNA对ICSI转基因效率的影响。结果表明，5ng/μL的质粒pEGFP-N1与绵羊冻融精子共孵育后，ICSI转基因的效率最佳，卵裂率、囊胚率和胚胎阳性率分别达到84.7％、8.8％和87.3％。
经过如上体系的确立，使用Piezo装置对绵羊体外成熟的卵母细胞实施单精注射，获得平均为85.1％的卵裂率，7.6％的囊胚率，胚胎阳性率平均达到了79.1％。将135枚绵羊单精注射胚胎(包括85枚早期胚胎、35枚桑椹胚利15枚囊胚)移植到24只同期发情的小尾寒羊受体。其中有1只受体在胚胎移植后第129天确定为怀孕，并在移植后第139天经剖腹手术顺利产下一只健康的雌性羔羊。这些结果为建立ICSI方法生产转基因动物的技术平台奠定了坚实的基础。
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