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蛛丝有着优良的机械性能和生物学特性,是一种性能比蚕丝更为优异的天然材料,在纺织、航空航天、军事、生物医学等领域具有广阔的应用前景。然而,蜘蛛掠食动物的天性和极低的产丝量堵死了人工饲养收集蛛丝的途径,使研究者们不得不寻求其它方法生产蛛丝纤维。近些年来,随着蛛丝越来越受到国内外研究人员的重视,对其结构表征、成丝机理、生产应用等方面的研究成果层出不穷。利用基因工程技术进行外源表达,尤其是通过原核宿主表达重组蛛丝蛋白,是目前获取蛛丝纤维的主流途径。但蛛丝蛋白基因序列重复程度高,结构复杂,给宿主细胞带来了巨大的代谢压力,也使得外源表达蛛丝蛋白的情况难以预测。另外,由于对蛛丝蛋白成丝机理的研究还非常有限,目前纺制蛛丝纤维所用的常规湿法纺丝工艺与天然蛛丝形成方式有很大的差异,从而导致人造蛛丝纤维的性能远低于天然蛛丝。由于人工蛛丝仿生技术的不成熟和重组蛛丝蛋白原核表达的不确定性,直至目前,还没有一家机构能实现高性能蛛丝纤维的工业化生产。本论文设计了一类新型嵌合体蛛丝蛋白序列。通过系统性研究该类蛋白的原核表达和成丝机理,证明了该类嵌合体蛋白保留了蛛丝蛋白的结构和成丝特性,为解决重组蛛丝蛋白原核表达困境提供了新的思路,填补了嵌合体蛛丝蛋白成丝机理的空白。同时,本课题还对嵌合体蛛丝蛋白在组织工程领域的应用前景进行了评估,并对蛛丝纤维大规模生产的技术路线进行了探索,为高性能蛛丝纤维的工业化生产奠定了坚实的理论和技术基础。本研究的主要内容包括以下四个课题:一、研究新型嵌合体蛛丝蛋白的表达情况、结构和成丝机理。蛛丝蛋白通常由保守的N端非重复区（NT）、C端非重复区（CT）、以及核心重复区这三个结构域构成。不同种蛛丝蛋白,其核心重复区的各氨基酸残基的比例和排列也有很大差异。在之前的研究中,设计的重组蛛丝蛋白往往由亲缘关系相近的蛛丝蛋白融合而成。但这类人工蛛丝蛋白在研究成丝机理方面,不能排除自然条件下NT、CT、重复区结构域共同进化带来的潜在影响。因此,为排除三域共同进化对实验结果的干扰,因尽量选择亲缘关系较远的蛛丝蛋白模块进行研究。此外,考虑到原核表达重组蛛丝蛋白可能遇到的困难,本课题最终选择来自Eupros-thenops australis（南非盗蛛）MaSp1的NT模块,来自Araneus ventricosus（大腹园蛛）MiSp1的CT模块,这两个高表达量、高溶解度的结构域与14个Ar-giope trifasciata（三带金蛛）AcSp1的重复模块（W）进行融合,构建了一类由不同种蜘蛛不同类蛛丝蛋白模块组成的新型嵌合体蛛丝蛋白NTW1-4CT。原核宿主（E.coli）表达结果与预期一致,将合适的蛛丝蛋白末端结构域与重复区模块融合能有效提高嵌合体蛛丝蛋白的溶解度和表达量。与其它人工蛛丝蛋白类似,随着重复区数量的增加,嵌合体蛛丝蛋白的溶解性和产量会逐渐降低。对蛛丝蛋白的实验分析表明,尽管NT、W、CT结构域之间的亲缘关系较远,但在嵌合体蛛丝蛋白中仍能保持各自的特性和功能。NT和CT模块也能仅在剪切力作用下指导蛛丝蛋白核心重复区的构象变化,从而提高手工拉伸丝纤维的机械性能。本章的结果不仅表明,与高溶解度、高表达量的末端结构域融合,能有效提高原核表达嵌合体蛛丝蛋白的产量和可溶性,而且还证明了蛛丝蛋白的结构域在不受共同演化的影响下也能保持各自的特性和功能。此外,该课题的研究拓展了原核表达重组蛛丝蛋白序列的设计思路,也为定制具有特定材料学性质的丝纤维奠定了基础。二、探索蛛丝蛋白仿生纺丝条件。上一课题中通过手工拉伸获得的NTW14CT丝纤维,由于产量低、性能不稳,无法进行大批量的生产。而常规的蛛丝蛋白湿法纺丝工艺往往需要使用六氟异丙醇（HFIP）、甲酸、甲醇等高挥发性有机试剂,这不仅会对环境造成影响,也与蛛丝蛋白的天然成丝过程差异巨大,导致重组蛛丝纤维无法达到最佳的机械强度。因此,本章参考了棒络新妇（Nephila clavipes）主壶腹丝腺的结构和内环境,搭建了相应的纺丝装置,探讨了仿生湿法纺丝的条件,并成功通过仿生湿法纺丝工艺将NTW1CT纺制成丝纤维。与常规湿法纺丝结果相比,仿生湿法纺丝纤维NTW1CT-BNB（pH 5.3,pH 5.6）表面光滑,横截面呈致密的实心结构,类似于手工拉伸的NTW1CT纤维。此外,相较于手工拉伸的NTW1CT纤维和常规湿纺纤维NTW1CT-DCB,NTW1CT-BNB（pH 5.6）有着更高的机械强度和杨氏模量,但韧性和拉伸率均有所降低。从FTIR图谱可以看出,NTW1CT-BNB（pH 5.6）的二级结构有较手工拉伸NTW1CT纤维更多的β-structure以及更少的α-helix,从而导致了该类丝机械性能与其它纤维的差异。然而,NTW1CT-BNB（pH 5.6）的结构与天然葡状腺丝仍存在着很大的差异。因此,虽然通过现有的仿生湿法纺丝工艺可以获得具有较高机械强度和杨氏模量的仿生纤维NTW1CT-BNB（pH5.6）,但后续仍需对葡状腺的结构和内环境进行研究,从而仿生天然葡状腺丝成丝条件,为纺制更高性能的嵌合体蛛丝蛋白纤维做准备。三、利用家蚕丝腺生物反应器一步获取嵌合体蛛丝纤维。从古至今,家蚕都是天然丝纤维的主要来源。家蚕丝腺作为生物反应器具有成本低、安全性高、易产业化等优点,而家蚕丝素蛋白与蛛丝蛋白在结构上的相似性又使得通过家蚕生产蛛丝纤维具有很高的可行性。近年来,国内外多家研究机构对转基因家蚕生产蛛丝纤维进行了一系列研究,但都集中于对MaSps和MiSps的生产。本章采用CRISPER/Cas9基因编辑技术,首次尝试通过转基因家蚕生产以AcSp重复模块为核心的嵌合体蛛丝蛋白。通过实验室已有的Donor质粒框架,设计并制备了分别含有NTW1CT和NTW4CT两种蛛丝蛋白基因的Donor质粒pMD-18-S-NTW1or4CT及相对应的单链供体模板（ssODN）。将ssODN与分别识别丝素重链蛋白（Fib-H）基因上下游序列的sgRNA1、sgRNA2载体以及Cas9核酸酶质粒混合,用显微注射器注入家蚕蚕卵中。随后,家蚕胚胎利用同源定向修复（HDR）机制,将蛛丝蛋白基因序列整合至家蚕基因组上并取代了家蚕Fib-H基因。实验结果显示,通过报告基因筛选得到的转基因家蚕能够稳定遗传NTW1CT和NTW4CT蛛丝蛋白基因。其中,蛛丝蛋白NTW4CT可通过家蚕丝腺反应器生产,并以杂合丝的形式存在于家蚕茧中,证实了蛛丝蛋白AcSp重复区模块也可通过转基因家蚕进行生产,从而使大规模制备嵌合体蛛丝纤维成为可能。四、静电纺蛛丝蛋白/高分子化合物共混纳米纤维支架并评估该复合材料在血管组织工程中的应用。聚乳酸聚己内酯（Poly（L-lactic-co-ε-caprolactone）,PLCL）是一种常用的静电纺材料,以它纺制的纤维膜具有良好的机械性能。但由于该类纤维膜表面过于疏水且缺乏细胞结合位点,因此生物相容性较差。本章将适量的新型嵌合体蛛丝蛋白NTW14CT与PLCL混合进行静电纺,可制得一类共混纳米纤维支架NTW14CT/PLCL（25/75,w/w）。对共混支架的表观、结构以及材料学性能研究发现,添加嵌合体蛛丝蛋白可提高纺丝原液的导电性,降低溶液粘度,从而提高共混支架的孔隙率,并随着重复区模块W的增加逐渐升高。其中,在与含有4个W模块的蛋白NTW4CT混纺后,共混支架的强度显著高于纯PLCL支架。此外,在静电纺过程中,嵌合体蛛丝蛋白的二级结构由α-helix为主转变为α-helix与β-sheet并存,这与天然蛛丝蛋白成丝过程中构象的转变相类似。而该过程可能随着重复模块的逐渐增加从而使纳米纤维中蛛丝蛋白结构越来越接近亲水的天然蛛丝,从而使共混支架表面由疏水转变为亲水。体外实验表明,在NTW1or4CT/PLCL（25/75）共混支架上培养的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的增殖及粘附活性明显高于纯PLCL支架上的细胞。而由于NTW4CT/PLCL（25/75）共混支架适度的亲水性,该支架有着最佳的细胞相容性。上述实验说明,嵌合体蜘蛛蛋白/PLCL共混纳米纤维支架,特别是NTW4CT/PLCL（25/75）支架在血管组织工程领域有潜在的应用价值。